微重力介导角膜基质细胞的iPS诱导及其角膜内皮细胞分化

在前期的研究中，我们发现在模拟微重力培养环境下，角膜基质细胞由梭形和树枝状变为圆形，呈现大核和少胞浆，此为iPS细胞的形态学特征，因此，微重力培养可能有助于产生iPS细胞。本项目通过微重力细胞培养联合丙戊酸、曲古抑素A 和5-脱氧杂氮胞苷等改善重编程效率的物质，通过逆转录病毒或质粒载体插入Oct4、Sox2和Klf-4基因的重编程技术，将角膜基质细胞重塑为iPS细胞。采取改变培养液成分、细胞共培养、特殊培养和移植后体内诱导等方法，促进iPS细胞进一步向角膜内皮细胞的分化。本项目拟利用微重力环境，建立和优化角膜基质细胞向iPS转化以及iPS向角膜内皮细胞分化的实验体系，并在该过程中研究体细胞重编程及干细胞定向分化中的相关机制。与此同时，探索使ViPS的重编程技术过渡到CiPS技术的新方法方法。本课题为解决难于治愈的角膜内皮细胞病变提供新的路向。

背景：通过微重力细胞培养、小分子化合物、Oct4 /KLF4/Sox/c-Myc转染重编程、细胞共培养等技术促进角膜基质细胞重编程与iPS分化为角膜内皮细胞研究。主要内容：1. 角膜基质细胞常规、球形及微重力培养。2.角膜基质细胞重编程及iPS诱导。3. iPS细胞分化为角膜内皮细胞。重要结果：1. VPA、VC、PRP、有序排列微模板和Vitrigel培养促进角膜基质细胞生长。2.微重力培养促进角膜基质细胞发育早期形态的球形细胞生长和片状生长。3. 国内外首次证明iPS细胞存在PAC1受体，PAC1受体特异激动剂Maxadilan对iPS有促增殖和抗凋亡作用。4. 成功纯化重组蛋白PTD-Oct4/KLF4/Sox2；重组蛋白可以穿入细胞膜与核膜，与各自的靶DNA序列特异性结合；PCDNA3.1-PTD-Oct4 /KLF4/Sox/c-Myc真核表达系统可穿入角膜基质细胞。5.应用PTD-Oct4/KLF4/Sox2融合蛋白及VPA作用于角膜基质细胞后，可出现少量的胚胎干细胞和一定的成体干细胞标志。6. iPS与角膜内皮细胞共培养，促进iPS向角膜内皮细胞分化。关键数据：1. 加入VPA和VC，角膜基质细胞在脱细胞角膜基质载体培养呈树枝状及网状细胞连接结构，同样条件在微重力下培养，角膜基质细胞呈圆形聚集样生长，keratocan和lumican 的mRNA表达阳性。2. iPS细胞表达PAC1 mRNA和三种蛋白亚型，紫外照射导致iPS的凋亡细胞增加587%，加入30 nM 的Maxadilan后iPS的凋亡细胞仅增加224%。3. PTD-Oct4/KLF4/Sox2重组蛋白穿细胞膜效率为22.29%-40.86%。4. 重组PTD-Oct4/KLF4/Sox2和VPA小分子诱导第七次循环后，CD34和Vimentin细胞表型染色阳性，qRT-PCR显示Nanog、Oct-4和Nestin基因表达轻度增加。5. iPS与兔角膜内皮细胞混合接触共培养后人iPS细胞向内皮样细胞方向转化，表达角膜内皮细胞标志蛋白AQP1，10 nmol /L 量子点标记的 iPS细胞以1 /4 悬液与融合60%的兔 CECs 共培养为最佳模式。科学意义：解决促进iPS活力、更安全的重编程诱导及分化的科学问题，对iPS定向分化为角膜内皮细胞及修复角膜内皮病变提供可靠的实验和理论依据。