用于肿瘤干细胞miRNA检测和酶切的双功能自组装杠铃探针体系的构建及初步应用研究

MicroRNA( miRNA) is a kind of short, noncoding RNAs that powerfully regulate gene expression at the post transcriptional level. It was revealed that miRNA regulated cell proliferation, differentiation, apoptosis and various physiological and pathological pathways in tumor stem cell. MicroRNA's abnormal expression in tumor stem cell is closely related to the process of tumor occurrence, development, metastasis, drug resistance, recurrence, etc. MiRNA of tumor stem cell is a new target for diagnosis and therapeutic tumor. Detection and expression analysis of miRNA are significant to the understanding of functional mechanism of miRNAs and the diagnosis. Aimed to detection and treatment research of the tumor stem cell miRNA, this project mainly includes three aspects: Design and construction of a detection and cleavage dual-functional self-assembly barbell fluorescent probe based on three platforms, such as polymerization primer recognition, DNAzymes and DNA palindrome structure technology; establishing fluorescence signal amplifying detection system of isothermal circular strand-displacement polymerization reaction based on the novel dual-functional barbell probe and development of new methods with high sensitivity, high selection, high convenience and efficiency for the detection of miRNA; research of miRNA regulation mechanism with the novel system. The system will provide a good strategy for tumor prevention, early diagnosis, prognosis, therapy and clinical guidance.

肿瘤干细胞miRNA是肿瘤干细胞增殖、分化及凋亡的重要调控因子，它的异常表达与肿瘤的发生、发展、转移、耐药及复发等过程密切相关。肿瘤干细胞miRNA正成为肿瘤诊断和治疗的新靶点。本项目针对肿瘤干细胞miRNA的检测及治疗开展研究，结合分子探针技术、生物技术以及化学、酶学、肿瘤学等多学科知识，利用聚合引物识别、脱氧核酶及核酸回文结构技术三大平台，设计研制具有检测和酶切双功能的新型自组装杠铃荧光探针，构建基于新型双功能杠铃探针的等温链置换循环放大反应平台，建立高灵敏、高选择、方便快捷的miRNA检测新方法，开展肿瘤的酶切治疗研究及肿瘤干细胞miRNA 调控机理研究，为肿瘤预防、早期诊治、预后判断及治疗提供临床指导作用。

肿瘤是危害人类健康的最重要威胁之一。治疗癌症的关键是早诊断、早治疗。但是鉴于癌症早期无症状或症状不明显,癌症早诊早治极为困难,且其确诊大多都有创伤性。.此项目基于聚合引物识别/链置换/核酸适配体/核酸杂交/自组装/工具酶/核酸探针等技术, 建立了八种检测肿瘤发生发展的监测体系，并用于肿瘤细胞/肿瘤标志物miRNA/肿瘤活性物质/与肿瘤相关病毒的诊断与检测及相关研究分析。构建了一种基于聚合酶链置换循环扩增的无标记长尾核酸探针体系。在此体系中，核酸探针既可以作为靶分子的识别探针又可以是聚合酶的反应模板，设计简单、操作简便，成本低。在等温条件下实现循环聚合反应，克服外源性污染导致的假阳性反应，对肿瘤标志物miRNA进行定量检测分析；发展了一种基于新型发夹核酸探针介导信号放大方法用于高灵敏检测核酸（DNA或miRNA）。新型长尾核酸探针的长尾在引物退火延伸过程中延能长双链DNA 产物，与循环扩增反应相结合，提高核酸检测的灵敏度，检测下限达到50 aM；发展了一种基于核酸外切酶I的新型核酸探针用于超灵敏检测核酸。使新型核酸探针的检测灵敏度达到PCR级的检测水平，检测下限为5 zM，比一般分子信标探针的检测下限降低了6个数量级。此外，该方法也能检测相似度很高的不同miRNA分子，其检测下限也达到5 zM；基于cell-SELEX筛选技术和已经建立的细胞核酸适配体筛选平台，首次将SWCNT纳米材料引入细胞核酸适配体筛选过程中，利用SWCNT能够有效地吸附单链DNA的特性，高效的去除筛选过程中未与靶标结合的单链DNA和弱结合的单链DNA，仅通过6轮筛选，即获得了一组高亲和力、高特异性识别的核酸适配体，缩短筛选周期，极大地提高筛选效率，为核酸适配体的高效筛选提供了新的方法和技术平台；通过该平台筛选得到的人肝癌细胞株HepG2核酸适配体，构建肝癌细胞的高灵敏检测体系，有望用于核酸适配体传感器的构建和生物临床应用研究。.本项目建立的高灵敏、高选择、方便快捷的检测平台和体系，为肿瘤预防、早期诊治、预后判断及治疗提供临床指导作用。