基于表面展示胞内抗体技术研究多功能域泛素连接酶TRIM39的多靶点结合机制

In recent years, the ubiquitin ligase family has attracted increasing attention for its potential to be functioned as targets of the anti-tumour drugs, because most of its members bind to their specific substrates and modify them with ubiquitin. TRIM39 is a significant ubiquitin ligase that reacts with some critical factors that participate regulation of cell apoptosis and tumorigenesis. In this project, we will screen the specific ScFv intracellular antibodies (intrabodies) that bind target domains of TRIM39 by using the surface display technology performed with the S-layer proteins,as well as the immunomagnetic cell sorting technology. By use of the thermoresponsive nano micelles, we will subsequently realize delivery of the intrabody genes to specific cell lines, the corresponding thermoresponsive expression, and location of the ScFv intrabodies at target positions within cells. Through technology including differential expression, mechanisms of the target binding of ScFv intrabodies onto the muti-domains of TRIM39 will be interpretated. Combining the structural analysis of the protein complexes, this study will contribute to comprehensive understanding of the anti-tumour targets within particular domains of TRIM39, thus providing the possibilities for effective design of the anti-tumour drugs using TRIM39 and its ligand proteins as targets.

近年来，能高度特异地对多种蛋白底物进行泛素化修饰的泛素连接酶家族被作为药物靶点在国际上日益受到关注。泛素连接酶TRIM39可作用于多种细胞凋亡-肿瘤发生的相关因子，本项目将基于S-层表面展示胞内抗体技术和免疫磁细胞分选的方法，筛选与TRIM39蛋白功能域特异性结合的ScFv抗体，然后采用温敏性纳米胶束将ScFv抗体基因传递到目标细胞系，通过调节细胞培养温度实现ScFv抗体基因在特定细胞部位的应激表达，并通过差异表达等技术揭示ScFv抗体靶向结合TRIM39多功能域的作用机制，结合蛋白质复合物结构分析方法，探索TRIM39特定功能域的抗肿瘤靶点，为进一步以TRIM39及其配体为靶点的抗肿瘤药物筛选提供科学依据。

肿瘤相关蛋白的结构与功能研究对于肿瘤发生、肿瘤细胞迁移机制的理解和阐述有重要意义，能够为相关复合物参与调控路线、药物与蛋白靶向结合研究提供理论依据。能高度特异地对多种蛋白底物进行泛素化修饰的泛素连接酶家族近年来被作为药物靶点在国际上日益受到关注。泛素连接酶TRIM39能通过结合多个功能域与多种配体形成复合物在不同组织中调控肿瘤形成-细胞凋亡两个方向。但其不同结构域的调控机制目前鲜有报道。本项目首次基于S-层表面展示胞内抗体技术和细胞表面荧光免疫分选的方法，筛选了TRIM39蛋白不同区段功能域的抗体重链可变区单链抗体(VH)，构建了特异性结合TRIM39相应区段的胞内抗体，以其研究了TRIM39蛋白不同截段在肿瘤P53阳性和阴性肿瘤细胞中的凋亡作用。研究以TRIM39 N’-段和C’-段多肽作为抗原免疫实验小鼠，从其脾细胞提取了总RNA，以之作为模板反转录得到了cDNA文库。应用抗体重链及轻链可变区序列的通用兼并引物扩增制备了相应重链及轻链的DNA文库。将其克隆到苏云金芽胞杆菌-大肠杆菌穿梭型表面展示质粒体系中，分别转化至苏云金芽胞杆菌和大肠杆菌进行表面展示，结果发现大肠杆菌生长受到抑制，而采用苏云金芽胞杆菌作为宿主菌成功筛选到能够特异性结合TRIM39两段肽段的抗体重链可变区及其基因。进而将相应的抗体基因克隆至动物胞内表达，转化至P53阳性人肝癌细胞HepG2、P53部分缺失的人肺腺癌细胞H1299和正常人胚肺成纤维细胞细胞HELF中，进行了抗体对细胞凋亡的影响。我们的研究结果表明，该工作为TRIM39蛋白和其它蛋白的抗体筛选及蛋白结构域的功能研究提供新的方法。研究同时构建了系列用于基因转染运载体和pH敏感的蛋白类药物释放体系。