同卵双胞胎食管癌患者全基因组外显子测序和变异基因功能研究

Monozygous twin (MZ) patient with esophageal cancer, genetically identical at birth, is an ideal model to elucidate the key molecular changes for esophageal carcinogenesis and to represent a unique resource to separate inherited from environmental factors. The progress for twin and esophageal cancer is embarrassed because of low birth rate of MZ (1/250 newborns) and rare MZ esophageal cancer patients. With the support of National Natural Science Foundation of China (No. 30025016 and 30971133, finished), we have established a databank of 1929 pairs of twins (≥45 years old), including 109 pairs with malignant diseases. Of the cancer patients, there are 52 pairs with esophageal cancer (40 cases from MZ). Also, we have 77 pairs with esophageal precancerous lesions (58 cases from MZ). The cordant rate for esophageal cancer and precancerous lesions is 22% and 14%, respectively. Methylation analysis by whole-genome methylation sequencing has identified 80 hypermethylation sites at promoter regions on 19 pairs twins with esophageal cancer and precancerous lesions. Obviously, to further correlate these hypermethylation changes with gene mutation is of crucial role in elucidating the molecular mechanisms of esophageal carcinogenesis. The present study is thus designed to identify the genetic mutations by whole-exome sequencing on this unique resource of twin samples with esophageal precancerous and canerous lesions. Then, we will characterize these gene expressions with clinic outcome and hypermethylation to identify the promising candidate molecular biomarkers for high-risk subject screening, early detection and targeted therapy for esophageal cancer.

同卵双胞胎（MZ）食管癌是阐明食管癌变关键分子，甄别环境和遗传因素对食管癌变影响的理想模型。但MZ出生率极低（总新生儿1/250），MZ食管癌患者更少见，限制该研究领域的进展。本研究组在国家杰青和双胞胎面上项目（30025016，30971133）支持下，已完成1929对双胞胎生物样品信息资料库建设，发现109对恶性肿瘤患者，其中食管癌52对（同卵40对），食管癌前病变77对（同卵58对），同卵食管癌和癌前病变一致性分别为22%和14%；19对食管癌和癌前病变全基因组甲基化测序发现80个启动子区高甲基化位点。很显然，进一步了解这些甲基化变化与基因变异的关系，对阐明食管癌变分子机制具有重要意义。本研究正是利用这一独特的双胞胎食管癌病例资源优势，进行全基因组外显子测序，甄别食管癌基因变异，比较这些基因表达变化与临床表型和甲基化谱等关系，为建立食管癌高危人群筛查和早期发现的候选分子提供依据。

本项目实施4年来，均超额完成申请书中的各项研究计划。.1、本项目预定研究内容：.（1）对比分析20对同卵双胞胎食管癌患者和正常个体间全基因组外显子测序的差异，初步确定食管癌相关主要突变位点和基因；.（2）在300例非同卵双胞胎食管癌组织中进行相关主要突变位点验证；.（3）食管癌关键突变基因蛋白表达变化对食管癌变的影响；.（4）同卵双胞胎食管癌全基因组外显子测序和全基因组甲基化测序结果对比分析。.2、本项目研究目标.建立国人同卵双胞胎食管癌组织全基因组外显子测序大数据库；甄别同卵双胞胎食管癌相关候选关键突变基因，进一步与同卵双胞胎食管癌全基因组甲基化测序结果对比分析，加深对这些变异基因在食管癌变中的作用和意义的了解，为建立食管癌高危人群筛查，早期发现和靶向治疗等候选靶分子提供依据。.3、项目执行完成情况：.（1）同卵双胞胎资料库的建设和完善：.继续跟踪随访同卵双胞胎的发病和生存状况，结果发现2例新发生同卵双胞胎单发食管癌患者.（2）全基因组外显子测序：.利用同卵双胞胎的两个个体具有完全相同遗传背景、能够最大程度降低因遗传背景噪音对全基因组外显子测序统计结果影响的优势，本研究组采用全基因组外显子测序技术对20对同卵双胞胎单发食管癌患者和正常个体的20个食管鳞癌组织和10个配对癌旁组织及20个正常个体的食管正常上皮组织进行200X深度的测序分析，获得65个高频突变位点和基因；.（3）Sanger 测序验证.在450例（原计划300例）非同卵双胞胎食管癌患者的癌组织和配对癌旁组织中对此65个高频突变基因进行Sanger 测序验证，验证出15个与食管癌变密切相关的基因；.（4）食管癌关键突变基因蛋白表达变化对食管癌变的影响.本研究团队在项目执行期间，制作完成了10000例的食管癌组织芯片，在这10000例单发食管癌组织芯片中对以上发现的15个基因相关蛋白进行表达验证工作，结果发现其中10个蛋白在食管癌组织中的表达远远高于其在正常食管上皮中的表达，其中4个蛋白与食管癌患者生存预后相关。；.（5）同卵双胞胎食管癌全基因组外显子测序和全基因组甲基化测序结果对比分析。在外显子测序验证中找到的15个基因与全基因组甲基化测序结果的比对中，共发现有2个共同的基因位点。