拟南芥根响应缺磷的磷酸化蛋白组学研究

Phosphate (Pi) deficiency impairs plant development and growth in many agricultural ecosystems, causing severe reduction in crop yield and quality. While the tanscriptional response to Pi deficiency has been expansively documented, limited information is available with regard to the Pi deficiency-induced changes of the posttranslational modifications (PTM). PTM is one of the protein processes required for the newly-synthesized protein maturity and function, therefore plays crticle roles in the living organism. Previously, comprehensive analysis of the transcripteome and protome profiling in phosphate-deficient Arabidopsis roots, conducted by RNAseq and iTRAQ (Iobaric Tag for Relative and Absolute Quantification) based quantitative proteomic techniques, reveals that both transcriptional and posttranscriptional gene regulations are involved in the adaption to Pi deficiency. To extend previous research, in this study, with the attempt to decipher how protein phosphorylation is changed and what the roles of protein phosphorylation is involved in upon Pi deficiency, quantitative phosphoproteomic analysis of Arabidopsis roots subject to short-, medium-, and long-term Pi deficiency will be carried out using iTRAQ technique combined with phosphopeptide enrichment. In addtion, Combining previous transcriptional and proteomic researches with present study, we could provide a relatively complete picture of how plants respond and adapt to Pi deficiency through multiple layers of gene regulation, i.e. gene transcription, protein translation, and posttranslational modification, etc. To validate our analysis, the roles of phospho-sites of some Pi-deficient induced phosphopeptides derived from regulatory proteins will be tested by site-directed mutagenesis via reverse genetic studies. To our knowledge, it would be the first time to uncover the global changes in protein phosphorylation under Pi deficiency in Planta. We believe that study here would set the stage for future researches on crops responding to low Pi stress and provide some useful gene sources for crop breeding.

缺磷限制植物生长发育，导致作物产量和品质严重下降。缺磷响应机制在转录水平已有深入研究。我们前期对拟南芥根响应缺磷的转录组和蛋白组进行了系统分析，但在全基因组水平上，针对在蛋白成熟和功能发挥中起关键作用的翻译后修饰的研究还明显不足。本项目以缺磷处理不同时间的拟南芥根为材料，分别提取总蛋白和膜蛋白，酶解后富集磷酸化肽段，采用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术开展定量磷酸化蛋白组学研究。研究结果将明确根系缺磷条件下蛋白磷酸化状态及其动态变化规律，并以此推测蛋白磷酸化修饰在缺磷响应中的生物学过程；鉴定缺磷诱导的蛋白磷酸化修饰，发现关键磷酸化蛋白基因，解析其生物学功能；整合前期转录组学和蛋白组学研究结果，探讨植物在基因表达调控的各个层面应对缺磷的分子网络。项目的实施将弥补当前对植物磷营养蛋白磷酸化研究的不足，进一步完善对植物缺磷响应的系统认识，为磷高效利用作物育种奠定理论基础并提供基因资源。

磷是植物包括作物生长发育所必须的大量元素，磷元素主要以无机磷（Pi）的形态在根中被植物吸收，参与了细胞内能量转化、信号转导、大分子合成，特别是光合和呼吸作用等重要的代谢过程。缺磷是作物产量和品质的一个主要限制因子。缺磷响应的生理、形态、和基因转录水平的变化已有大量而深入的研究，但是转录水平的变化并不能完全代表蛋白水平和蛋白翻译后修饰的改变。蛋白磷酸化修饰在蛋白功能调节中发挥重要的作用，但蛋白磷酸化修饰是如何应答缺磷胁迫的机制还不清楚。本项目以拟南芥根系为研究对象，研究了缺磷后根系蛋白的磷酸化变化，综合分析了缺磷后基因活性在核酸（RNA）、蛋白、磷酸化水平的关系，并初步探讨了一个缺磷诱导上调的蛋白激酶的生理功能。. 通过分析，我们共鉴定到1253个特异的磷酸化肽段，其中丝氨酸位点的磷酸化是主要的方式，占60%，而缬氨酸位点磷酸化只有11%，表明拟南芥中也可能在其他高等植物中，丝氨酸位点是蛋白磷酸化的主要修饰位点；这1253个肽段来自723个蛋白，基因本体（GO）分析，表明这些蛋白编码基因主要参与了各种生物学过程，其中蛋白豆蔻酰化、对脱落酸的应答及对镉离子的响应是高度富集的；在1253个蛋白肽段中有242个肽段可以进行定量化分析，通过统计分析发现，各有10个肽段显著受缺磷诱导上调和下调，这些肽段蛋白编码基因主要参与了三羧酸循环过程、微丝形成和解聚、蔗糖代谢等过程；结合前期转录组和蛋白组数据，我们对磷酸化肽段的蛋白及其基因的改变和磷酸化肽段自身的变化进行了综合分析，发现核酸、蛋白和肽段磷酸化修饰的变化没有相关性，说明植物响应缺磷胁迫的复杂性和调控的精细性；最后我们对一个缺磷诱导上调蛋白激酶基因的生理功能进行了探讨，发现该基因突变后根毛长度变短，而过量表达导致根毛变长。本项目通过对拟南芥根系缺磷的磷酸化蛋白组学研究，挖掘了缺磷调控的磷酸化肽段及其位点，综合分析了磷酸化肽段的变化规律，探索了缺磷诱导蛋白激酶的生理功能，为作物磷高效的遗传改良提供了充足的理论基础和丰富的基因资源。.