葡萄糖调节蛋白78促进肝细胞癌侵袭的细胞结构基础及机制研究

侵袭和转移是肝细胞癌病人最主要的死亡原因，也是肝细胞癌预后不良的最重要原因之一。我们前期的研究显示，葡萄糖调节蛋白78（Grp78）对肝细胞癌的侵袭和转移具有促进作用。进一步的研究发现Grp78通过激活FAK-Src复合体，促进肝细胞癌的侵袭和转移，但这种促进作用的细胞结构基础和分子机制仍不清楚。我们最近的研究证实在肝细胞癌细胞表面存在Grp78的表达，应用Grp78抗体封闭细胞表面Grp78有效的抑制肝细胞癌的侵袭和转移。免疫共沉淀技术证实Grp78与Src可以直接结合，形成蛋白复合体。本课题在前期工作基础上，从手术切除组织、实验动物和细胞水平探讨细胞表面Grp78促进肝细胞癌侵袭转移机制，阐明Grp78与Src相互作用的细胞定位和分子机制，阐明Grp78促进肝细胞癌侵袭的细胞结构基础和分子机制，为临床上抑制肝细胞癌侵袭转移寻找一个有效的靶点，改善肝细胞癌的预后。

复发和转移是肝细胞癌病人预后不良的最重要原因之一，临床上缺乏有效的方法抑制肝癌细胞的侵袭和转移。研究表明GRP78对肿瘤侵袭和转移具有促进作用，但具体的分子机制尚不清楚。本项目中，我们首先应用RNAi技术特异性下调肝细胞癌细胞内GRP78的表达，促进肝细胞癌侵袭和转移的关键机制进行了研究，结果发现GRP78可以通过JNK依赖性方式调节MMP-2的表达及活性，促进细胞外基质的降解。为了进一步探明GRP78促进肝细胞癌侵袭和转移的分子机制，我们构建了GRP78 delATPase、G227D、delPBD和T453D突变体，并转染肝细胞癌细胞，结果发现GRP78对肝细胞癌细胞侵袭和转移的促进作用是通过其ATPase实现的。在此基础上我们通过免疫共沉淀实验证实了GRP78可以通过ATPase结构域与Src相互作用，GST-pulldown实验进一步证实这种相互作用是直接的。我们的研究还显示GRP78与Src之间的相互作用在GRP78介导的5-FU耐药性形成中具有关键的作用，将5-FU与Src抑制物联合应用可以显著提高GRP78高表达细胞对5-FU的敏感性。我们在对GRP78细胞定位的研究中发现GRP78可以表达于肝细胞癌细胞表面，对肝细胞癌细胞的侵袭和转移具有促进作用，应用针对GRP78氨基末端的特异性抗体封闭GRP78可以有效的抑制肝细胞癌的侵袭和转移，而羧基端的抗体对肿瘤的侵袭和转移没有影响，表明细胞表面GRP78促进肝细胞癌侵袭和转移是通过其氨基末端实现的。为了探明该现象的的机制，我们应用活化的α2-巨球蛋白处理肝细胞细胞，发现活化的α2-巨球蛋白可以促进GRP78向细胞膜转位，促进侵袭伪足的形成、Paxillin的重新分布。活化的α2-巨球蛋白可以促进EGFR和Src的结合，增强EGFR Y1101、Y845位点的磷酸化。但应用Src抑制物可以抑制细胞表面GRP78对肝细胞癌细胞侵袭和转移的促进作用，抑制EGFR Y1101、Y845位点的磷酸化，但不影响EGFR和Src的结合，这些说明Src的激酶活性可以促进EGFR的激活，但不影响EGFR和Src的结合。本课题的研究结果为肝细胞癌的抗侵袭、转移和提高肝细胞癌细胞对5-FU的敏感性提供新的线索，为基于 GRP78 为靶点的小分子封闭肽类及单克隆类药物的研究提供理论依据。