葡萄糖调节蛋白GRP78和GRP94对细胞保护作用的分子机制

The glucose-regulated proteins (GRPs) is a well-established ER (endoplasmic reticulum) chaperones. GRPs are essential for protein folding, assembly, traf?cking and cell stress in ER. In recent years, some GRP78 and GRP94 genes had been cloned successively in fish. This reports did not go deep into their function. Grass carp is good material for studying stress response in fish, We have cloned the full sequences of grass carp GRP78 and GRP94 cDNA. Our studies have shown that GRP78 and GRP94 would provide cytoplasm protection against thermal and Pb2+ stress. This protective effect will be weakened with the increase of the stress intensity. In the intense stimulation group, at the opposite of acting as a guardian, GRP facilitates cell apoptosis. In order to better understand the molecular mechanism of GRPs in protecting fish against stress, we plan to carry out the following studies. 1)To realize the relationship between GRP78 and GRP94 under stress. 2)To clone the promoter sequences of GRP78 and GRP94 and explore the multiple transcription patterns of GRPs. 3)To explore the molecular mechanism of GRPs in cytoprotection. 4)To analyse how GRPs to activate the PERK-eIF2a-ATF4 signal path. This project will help us further understand the roles of GRPs in cell protection, and ultimately provide the theoretical basis for fish healthful aquaculture.

葡萄糖调节蛋白(GRPs)是内质网中标志性的分子伴侣，参与蛋白质折叠、装配与运转和细胞应激。近年来陆续报道了鱼类GRP78和GRP94，但并没有涉及功能研究。草鱼是研究鱼类应激反应的很好素材，目前我们已克隆出草鱼GRP78和GRP94全长cDNA，研究表明GRP78、GRP94对细胞具有热保护、抗Pb2+作用。这种保护作用会随应激强度的加大而减弱，甚至还会诱导细胞加速凋亡。为了解草鱼葡萄糖调节蛋白参与细胞应激保护的分子机理，本研究拟开展以下研究：1、了解GRP78与GRP94的在应激反应中的相互关系；2、克隆GRP78和GRP94启动子序列，研究其多重转录模式；3、研究GRPs对细胞保护的分子机制；4、分析草鱼GRP78和GRP94如何激活PERK-eIF2a-ATF4信号通路。本项目的实施，有助于我们进一步了解葡萄糖调节蛋白对细胞保护的功能，最终为鱼类的健康养殖提供理论依据。

RP78和GRP94是主要的GRP家族成员，也是内质网驻留蛋白，在内质网应激情况下对细胞起着至关重要的保护作用。本课题运用分子生物学方法与技术，对草鱼GRP78和GRP94抗内质网应激的分子机制进行了研究。获得如下重要结果：1、草鱼GRP78与GRP94在温度、重金属等胁迫刺激的表达上调，而且过表达这两种蛋白质能提高鱼类细胞在内质网应激时的存活率，相反抑制这两种蛋白会降低细胞的存活率。因此鱼类GRP78和GRP94与哺乳类的一样具有抗内质网应激反应的能力。2、利用双荧光素酶系统分析，发现转录调控因子ATF4、ATF6等能够激活草鱼GRP78与GRP94的启动子，并在应激条件下上调他们的转录水平。3、我们发现草鱼GRP通过激活PERK-eIF2α-ATF4通路对细胞活性的影响，共免疫沉淀和GST-pulldown实验表明草鱼PERK和GRP78可以在正常条件下相互结合。然而，在内质网应激(TM刺激)下，PERK可以提高eIF2a的磷酸化水平。另外，CCK测定显示草鱼PERK在CIK细胞中的过表达降低了细胞活力。4、发现GRP78能够通过与pb2+的鳌合从而降低了其对细胞的毒害，从而探讨了GRP78抗重金属应激的分子机理。综上，该项目系统探讨GRP78和GRP94抗内质网应激的分子机制；同时对认识参与内质网应激成员之间的关系提供了重要的启示性线索。