噬菌体受体结合蛋白功能结构域介导的沙门氏菌快速检测的分子机制研究

Salmonella is one of the most important detection object in the field of food safety and hygiene. The core issues for its detection is to develop a rapid and accuracy detection method. Phages can specifically infect and lyse the host bacteria, thus contribute to the detection of the strains. Receptor Binding Proteins (RBPs), a novel molecular recognition component, is expected to expand the application of RBPs in the detection of pathogenic bacteria. In this project, Salmonella is used as the research target for the separation and purification of phages from different environmental samples. A library resources of bacteriophages will be established, and phages that can specifically lyse the strains of Salmonella Enteritidis or Salmonella Typhimurium; or phages with broad-host phage of Salmonella seravors will be selected. Comparative genomics, molecular biology, homology and microscopic morphology will be applied to elucidate the molecular basis of phage RBPs and its host strains, bring insight into the core functional domain for receptor-binding function in RBPs, and establish a simultaneous and rapid detection method for the detection of Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium induced by their recombinant protein which act as a molecular recognition. This study can provide a theoretical and experimental basis for the development of pathogens detection techniques based on novel RBPs-based molecular probes, and will also open up new ideas to develop rapid and accuracy methods for the detection of pathogens.

沙门氏菌是食品安全卫生检测领域中的重点检测对象之一，开发快速准确的检测方法是其检验研究的核心问题。噬菌体能特异性侵染、裂解宿主菌从而实现对宿主菌的检测。噬菌体受体结合蛋白(Receptor Binding Proteins，RBPs)作为新型分子识别元件有望拓展噬菌体在病原菌检测方面的应用。本项目拟以沙门氏菌为研究对象，从不同环境标本中分离纯化噬菌体，建立其噬菌体资源库，从中筛选对肠炎或鼠伤寒沙门氏菌具有特异性、对沙门氏菌多种血清型具有广谱性的噬菌体。综合运用比较基因组学、分子生物学、同源模建和显微形态观察等技术，阐明RBPs与宿主菌结合的分子基础，获取RBPs中发挥受体结合作用的核心功能结构域，建立以其重组蛋白为分子识别物介导的肠炎和鼠伤寒沙门氏菌的同步快速检测方法。该研究可为开发基于RBPs的新型分子探针建立病原菌检测技术提供理论和实验基础，也为病原菌快速准确检测方法研究开拓新的思路。

沙门氏菌是食品安全卫生检测领域中的重点检测对象之一，开发快速准确的检测方法是其检验研究的核心问题。噬菌体是能感染细菌并在其体内繁殖的一类病毒。噬菌体受体结合蛋白（Receptor Binding Proteins，RBPs），是由噬菌体基因编码的具有吸附和结合功能的一类蛋白的总称，一般位于噬菌体的尾丝或刺突中，有时也称为尾丝蛋白(Tail fiber)、尾突蛋白(Tail spike)或刺突蛋白(Spike protein)，是噬菌体识别宿主菌的元件。本项目以沙门氏菌为研究对象（宿主菌），从不同环境样品中分离纯化噬菌体，建立了沙门氏菌噬菌体资源库。采用生物学特性分析和透射电镜观察，从中筛选对肠炎和鼠伤寒沙门氏菌具有特异性、对沙门氏菌多种血清型具有广谱性的噬菌体。综合运用比较基因组学、分子生物学、同源模建、蛋白质工程等技术，阐明代表性短尾噬菌体LPST144和长尾噬菌体T102的RBPs与宿主菌结合的分子基础，获得RBPs中发挥受体结合作用的核心功能结构域。在此基础上，将重组RBPs蛋白作为分子识别元件与超顺磁性纳米磁珠（Magnetic beads）相偶联，构建重组RBPs-MBs复合物，对样品基质中的沙门氏菌进行磁分离和预富集处理，再结合实时荧光定量PCR（qPCR）技术，建立了快速、灵敏、特异的肠炎和鼠伤寒沙门氏菌同步快速检测方法。采用这种基于噬菌体重组RBPs蛋白磁分离（RBPs-MBs）的前富集处理与实时荧光定量PCR相结合的方法（RBPs-MBs-qPCR）同时检测样品中的肠炎和鼠伤寒沙门氏菌，样品制备和分析可在3h内完成，其检出限分别为162 CFU/mL（sdf）、201 CFU/mL（STM4495），方法特异性好。本项目研究结果可为开发基于噬菌体RBPs的新型分子探针建立病原菌检测技术提供实验和理论基础，也可为病原菌快速准确检测方法的研究开拓新思路。