竹节参三萜皂苷生物合成关键酶基因SS的克隆与表达调控研究

竹节参（Panax japonicus）属珍稀濒危的名贵"七类"中草药，具有南药三七活血化瘀和北药人参滋补强壮之功效，被誉为"草药之王"；其主要医药成分为三萜皂苷（triterpenoid saponins,TS），有抗衰老、抗癌、抗心肌缺血、调节免疫和降血糖等多种生物活性。目前野生竹节参资源匮乏，栽培数量极少、TS含量低使之应用受限。为了解竹节参TS代谢合成的分子机制以及提高其含量的遗传改良，本项目开展竹节参TS生物合成途径上关键酶基因SS的克隆和功能解析，研究SS基因的表达与竹节参TS积累的关系；同时构建高效植物表达载体，在竹节参毛状根中调控关键酶基因SS的表达，阐明SS基因在竹节参TS生物合成中的分子调控机制，为提高竹节参TS含量提供调控靶点、实现富含TS的竹节参生产栽培奠定理论基础。

竹节参（Panax japonicus）属珍稀濒危的名贵“七类”中草药，具有南药三七活血化瘀和北药人参滋补强壮之功效，被誉为“草药之王”；其主要医药成分为三萜皂苷（triterpenoid saponins,TS）。目前野生竹节参资源匮乏，栽培数量极少、TS 含量低使之应用受限。通过3年的系统研究，按计划完成了研究内容，取得了以下成果。.1、掌握了竹节参种子萌发的最佳条件，即150 mg/L GA3，浸种24h，温度25℃。建立了竹节参的离体培养体系。光照条件下愈伤组织诱导的最佳培养基是MS+1.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 2,4-D+0.1 mg/LKT；黑暗条件则为MS+1.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L KT。丛芽诱导最佳培养基：MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L GA3。生根诱导最佳培养基：MS+1.0 mg/L 6-BA+3.0 mg/L IBA。.2、成功克隆了竹节参三萜皂苷合成途径上的关键酶（鲨烯合酶）基因SS，其大小片段为1353bp，编码415个氨基酸。竹节参SS定位于叶绿体、线粒体和分泌途径。二级结构由α-螺旋（67.47％）、无规卷曲（22.41％）、延伸链（7.23％）、β-转角（2.89％）所组成，三级结构有N-糖基化位点，鲨烯/八氢番茄红素合酶位点1和2， N末端豆蔻酰化位点蛋白激酶C磷酸化作用位点，酪蛋白激酶II磷酸化作用位点。.3、成功构建植物表达载体pCXSN-Pjss和pCXSN-antiPjss，在烟草中实现遗传转化。建立了竹节参毛状根培养体系，成功构建了工程菌C58C1-pCXSN-PjSS 和C58C1-pCXSN-antiPjSS， SS质粒的C58C1菌液对竹节参茎段毛状根的诱导时间以25min为最佳，诱导率为90%；高浓度的NAA 和IAA对竹节参毛状根生物量的积累有抑制作用；IBA只有在1 mg•L-1时才有促进作用。.4、掌握了竹节参SS基因对竹节参TS代谢合成的分子调控。转基因竹节参毛状根中均检测到人参皂苷Re成分，SS正义转基毛状根能提高Re的含量（56.48 mg•g-1），SS反义转基因毛状根反而降低其含量（27.31 mg•g-1），说明SS基因的正义表达载体在转基因毛状根中已转录为mRNA，并呈现高水平，而反义表达载体则相反。