鳗弧菌六型分泌系统的调控机制及其在生态适应性中的作用

Various protein secretion systems exist in gram negative bacteria.Among of these, type VI protein secretion system (T6SS) has been found to play important roles in bacterial pathogenesis and in stress responses. Vibrio anguillarum,one of the gram negative species, is ubiquitous in marine environment,causing vibirosis in aquatic animals.Based on our previous study, the present project aims to investigate the regulation mechanism of T6SS of V. anguillarum and its role in ecological adaption, including:(1)screening and identification of the repressor gene(s) of T6SS in V. anguillarum strain M3;(2)analysis of the role of repressor gene(s) on M3 T6SS;(3)determination of the regulation route of M3 T6SS;(4)examination of the effect of activated T6SS on the physiological phenotypes of M3, including growth, motility and biofilm formation;(4)analysis of the impacts of various environmental stresses on T6SS and physiological phenotypes of M3;(5)determination of the effect of the M3 activated T6SS in the intra- and inter species cooperation or competition. The present study will give deeper understanding of the ecological fitness of V. anguillarum. We hope the relevant results provide new ecological strategy to control the Vibriosis in aquaculture.

革兰氏阴性细菌有多种蛋白分泌系统,其中VI分泌系统（T6SS）在细菌与宿主和环境的相互作用等方面有重要作用。鳗弧菌为一种革兰氏阴性菌，广泛存在于海洋环境,是养殖动物的重要病原菌之一。本项目在前期工作上，研究鳗弧菌T6SS的调控机制及其在生态适应性中的作用。通过筛选和鉴定抑制鳗弧菌T6SS表达和分泌的基因，研究该抑制基因对T6SS的调控作用，明确调控T6SS的路径，阐明T6SS在鳗弧菌生态适应性中的作用，揭示鳗弧菌的生态适应性机制，为从环境角度发现控制弧菌病发生的新途径提供理论基础。

VI分泌系统（T6SS）是革兰氏阴性细菌的一种蛋白分泌系统，T6SS在鳗弧菌适应生态环境的作用尚未得到阐明。本项目筛选和鉴定了抑制鳗弧菌T6SS表达和分泌的因子；研究了温度、盐度、pH、营养对鳗弧菌T6SS表达和分泌的影响；鉴定了5个调控基因对鳗弧菌T6SS表达和分泌的作用，建立T6SS的调控网络；明确了T6SS介导鳗弧菌的抑菌活性，5个调控基因影响其抑菌活性以及细菌的运动、菌膜形成、药物敏感性。.取得的主要成果：1. 发现了抑制鳗弧菌T6SS功能的基因。鳗弧菌有1-2套T6SS，有2个相同的Hcp，有三种表型：不产生也不分泌Hcp、 产生并分泌Hcp、产生但不分泌Hcp。不能产生Hcp的菌株出现在O1血清型菌株。鳗弧菌的tsrA基因保守，IS903插入到tsrA上游抑制了T6SS的表达，导致T6SS失去了分泌功能。2. 阐释了鳗弧菌T6SS的调控机制。鳗弧菌MHK3仅有T6SS2和两个hcp，Hcp1和Hcp2依赖T6SS2分泌。hcp2正调hcp1的表达，而hcp1负调hcp2的表达。有5个基因调控T6SS2和hcp的表达：rpoN和vasH正调控T6SS2，同时它们是hcp1和hcp2表达所必须的基因； tsrA正调控T6SS2、hcp1和hcp2；luxO正调控hcp1和hcp2；rpoS负调控T6SS2，正调控hcp1和hcp2。构建了T6SS2的调控网络。3. 阐明了T6SS在鳗弧菌适应生态环境的作用。MHK3的T6SS2在10-37°C、0.2-0.5% NaCl、pH 6-10组成型表达，在pH8–9、25℃、1%-3% NaCl中表达水平最高；在三种唯一碳源(葡萄糖，甘露醇，蔗糖）稳定表达，在对数生长后期至稳定生长期表达水平最高。鳗弧菌MHK3可以抑制多种革兰氏阴性菌的生长，T6SS2介导MHK3的抑菌活性，Hcp2的表达在T6SS2的抑菌功能中发挥决定性作用。5个调控基因（rpoN, vasH, rpoS, tsrA, luxO）通过调控T6SS的表达和分泌来调节T6SS的抑菌活性。rpoN和vasH影响细菌的运动、菌膜形成能力和药物敏感性。