霍乱弧菌6型蛋白分泌系统的分子调控机理

Gram-negative bacteria employ the type VI protein secretion system (T6SS) to deliver toxic protein effectors to eukaryotic and prokaryotic cells upon direct contact. This needle-like system is one of the largest intracellular organelles in bacteria with its length equal to the width of the rod shape cell, consisting of a multi-component membrane anchor and a long inner tube wrapped with an outer sheath. The T6SS was originally discovered in Vibrio cholerae, a waterborne bacterium and the causative agent for cholera disease. The T6SS genes in V. cholerae are encoded on a large cluster of structural genes and three small operons bearing genes coding for secreted proteins including Hcp, VgrG, and effectors. Interestingly, our preliminary results show that genes encoding secreted proteins, but not structural proteins, are down regulated in T6SS non-active mutants, suggesting a feedback regulatory control to shut down secreted protein production when the T6SS is not functional. In addition, we found that the constitutively active T6SS in V. cholerae strain V52 can be effectively repressed by reducing agents, suggesting the T6SS is sensitive to redox control. In the proposed research, we plan to identify the molecular regulatory mechanisms that allow the T6SS to sense secretion defects and redox conditions and determine the importance of such regulation for survival and fitness of V. cholerae in complex multispecies communities and interactions with the host.

蛋白分泌系统是细菌与外界环境发生相互作用的主要工具。 第VI型分泌系统（T6SS）在革兰氏阴性菌中广泛存在，由一个跨膜的多蛋白聚合体和与之结合的内、外双管针状结构组成。 T6SS在霍乱弧菌中被最先发现也是目前研究最多的模型。编码T6SS的基因分布在一个有20个基因的大基因簇和三个小基因簇，分别主要编码结构蛋白和分泌蛋白。我们的初步结果发现，当T6SS结构基因缺失的时候，分泌蛋白基因的表达会受到负调控而降低。这种反馈抑制可以避免分泌蛋白在T6SS失活的时候在胞内过量无效积累。另外，我们还发现T6SS的基因表达在霍乱弧菌遇到还原环境时受到显著的抑制，表明T6SS的调控与细菌体内外的氧化还原（redox）的平衡密切相关。在这个课题里，我们将利用多种分子生物学手段来研究和揭示T6SS对自身分泌缺陷和对还原环境的反应机理，推动本领域对T6SS这一广泛分布的分泌系统的生理生态学功能的理解。

蛋白质VI型分泌系统（T6SS）是革兰氏阴性菌中常见的一种蛋白转运工具，它可以将效应蛋白直接注射进真核或原核细胞体内。霍乱弧菌是人类霍乱的病原体，也是研究T6SS的模式菌株。在霍乱弧菌中， T6SS可以分泌多种毒性蛋白杀伤其他细菌和真核细胞，对致病性和菌群竞争十分重要。在这个项目中，我们综合使用了转录组、遗传和生化等工具，系统研究了T6SS在霍乱弧菌中的组装和调控机制，同时我们还比较了在不同种属之间T6SS作用机制的差异。该项目的主要发现包括以下内容：.1）我们发现了一种重要的T6SS负反馈调控机制，其能够在T6SS装置无法分泌蛋白时减少分泌底物的合成。当分泌蛋白Hcp在T6SS失活突变体中积累时，过量的Hcp可以与转录调控因子VasH结合，抑制其转录激活作用。这种调控机制可以帮助细胞减少合成过量的分泌底物，减轻代谢负担。.2）我们揭示了一种T6SS检测效应蛋白装载的自查机制，使得T6SS的每次分泌都能够有效运输效应蛋白，避免T6SS的无效合成。通过构建一系列效应蛋白的完全敲除和仅活性位点失活突变体，我们发现效应蛋白的存在对T6SS的组装至关重要。.3）我们发现T6SS尾管可以不依赖与膜-基座复合物而独立合成。在T6SS的非收缩突变体中，T6SS管状结构的合成和组装不需要膜-基座复合物的存在。这说明膜-基座复合物的主要作用不是领域内之前认为的用于启动管状结构合成，而是起到了稳定管状结构并避免其提前收缩的作用。.4) 我们发现了霍乱弧菌能够刺激铜绿假单胞菌T6SS“以牙还牙”现象的关键因子是效应蛋白。通过构建一系列T6SS效应蛋白的失活突变体，我们发现仅T6SS分泌的脂肪酶TseL是引起绿假单胞菌反击的关键因素。.5）我们发现了一类新型的T6SS自剪切效应蛋白，并揭示了其剪切机制。另外，我们还发现效应蛋白及分子伴侣对T6SS的组装都至关重要。.综上，这些成果不仅加深了我们对T6SS分子机制的理解，同时还为今后将T6SS设计成为新型的蛋白质运输工具靶向不同的细胞类型，控制细菌感染等提供了新的策略。