副溶血弧菌VI型分泌系统的表型功能及基因调控研究

Vibrio parahaemolyticus expresses two different type VI secretion systmes (T6SSs) called T6SS1 and T6SS2. The phenotpes and gene regulation of T6SS1 and T6SS2 of V. parahaemolyticus are still poorly understood. In this study, the phenotpic effects including lethality against mice, cytotoxicity, cell adhesion, and antimicrobial activity will be systematically characterized for T6SS1 and T6SS2 of pandemic V. parahaemolyticus; the primer extension, LacZ fusion reporter, protein expression and purification, gel mobility shift, and DNase I footprinting assays will be then carried out to characterize the trancscriptional regulation of T6SS1 and T6SS2 genes by the quorum-sensing (QS) master regulators OpaR and AphA; the final combined phenotpic and melecular dataset will promote us to gain the deeper understanding of distinct phenotpes and QS-mediated cell dencsity-dependent reciprocal regulation of T6SS1 and T6SS2 expression in V. parahaemolyticus.

副溶血弧菌表达两种 VI 型分泌系统（Type VI secretion system, T6SS），分别称作 T6SS1 和 T6SS2。有关副溶血弧菌 T6SS1 和 T6SS2 的具体功能及其基因调控机制，均不甚明确。在本研究中，将分析 T6SS1 和 T6SS2 在小鼠致死活性、细胞毒性、细胞粘附、抑菌活性等方面的功能表型效应；再通过引物延伸实验、LacZ 报告基因融合实验、蛋白表达与纯化、凝胶阻滞实验、DNase I 足迹实验，探究密度感应（Quorum sensing, QS）系统核心调控子 AhpA 和 OpaR 调控 T6SS1 和 T6SS2 基因转录的精细分子机制；最后将表型和分子实验数据结合起来，确证 T6SS1 和 T6SS2 的功能差异性，并确证由于 QS 调控引起的 T6SS1 和 T6SS2的菌密度依赖性的差异表达。

副溶血弧菌大流行菌株RIMD2210633表达两种VI型分泌系统（Type VI secretion system, T6SS），分别称作T6SS1和T6SS2。icmF1和icmF2分别是T6SS1和T6SS2的结构基因。本研究，我们首先构建了icmF1和icmF2的基因突变株（ΔicmF1和ΔicmF2）和突变株的回补株（C-ΔicmF1和C-ΔicmF2），进而探究了各菌株的毒力和生物膜表型，结果发现：ΔicmF1和ΔicmF2对副溶血弧菌的生长（仅在HI-0.5% NaCl）、swarming、swimming、溶血活性和生物膜形成能力，均无显著的影响（T6SS1对生物膜的形成能力，可能具有正调控作用）；ΔicmF1和ΔicmF2对HeLa细胞的粘附作用明显低于野生株或回补株的；ΔicmF1的抑菌活性显著降低，ΔicmF2的抑菌活性也野生株相比，无显著性差异。这些结果表明T6SS1主要调节副溶血弧菌的抑菌活性和对HeLa粘附活性，而T6SS2主要和该菌的粘附活性有关。另外，本研究还系统分析了密度感应（Quorum sensing, QS）系统核心调控因子AphA和OpaR调控T6SS1和T6SS2相关基因转录的精细分子机制，结果发现：（1）在模拟海洋环境培养基中，AphA在OD600=0.05-0.2时高水平表达，OpaR在OD600=0.4-0.6时高水平表达，且二者对T6SS1基因转录均具有抑制作用，因而导致T6SS1基因在OD600=0.6-0.8时高水平表达；（2）在模拟宿主体内条件的培养基中，AphA在OD600=0.08-0.35时高水平表达，OpaR在OD600=0.8-1.2时高水平表达，且AphA抑制T6SS2基因的转录，而OpaR激活T6SS2基因的转录，因而导致T6SS2基因的转录模式与opaR的一致。本研究，为我们理解副溶血弧菌T6SS1和T6SS2的功能，以及它们的表达调控机制提供一定的理论基础。