羊传染性脓疱病毒保护性抗原表位筛选及表位作图研究

羊传染性脓疱(Contagious Ecthyma，CE)俗称"羊口疮(Orf)"，是由羊传染性脓疱病毒（CEV）引起的一种急性接触性人畜共患病。该病在羊群中传播迅速、发病率高，常呈地方流行性。CEV属于副痘病毒，主要侵害宿主皮肤或黏膜，并可导致严重的持续性感染和继发性感染。当前国内外主要使用常规的灭活疫苗和弱毒疫苗防治该病，但易造成病毒变异株的出现、毒力返强以及活毒逃逸污染环境等后果。因此，研发Orf的多表位载体疫苗、核酸疫苗等基因工程疫苗具有广阔前景。鉴于新型疫苗的构建与病毒保护性表位基因的筛选密切相关，而且，国内外尚未有CEV抗原表位深入研究的报道，本研究旨在通过细胞融合技术制备CEV单克隆抗体，以筛选中和活性单抗或共享性单抗，完成表位作图，确定表位中关键性氨基酸残基或功能基团。本研究将确定副痘病毒的中和性抗原表位，并绘制表位图谱，为研发Orf的基因工程疫苗奠定基础。

本研究成功分离并纯化一株羊传染性脓疱病毒（ORFV）——黑龙江分离株OV/HLJ/04。针对OV/HLJ/04，选择其主要抗原蛋白之一的囊膜蛋白B2L进行原核表达，通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，获得了3株能够稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，其中单抗2E4具备了中和ORFV毒力的能力。抗体的间接ELISA试验和Western Blot证明2E4能够特异性识别B2L 蛋白，显示出良好的抗体-抗原特异性，为ORFV的实验室诊断提供了更为便捷的方法。继而，对B2L氨基酸序列进行测序和遗传学研究，采用DNAStar对B2L蛋白的B细胞抗原表位进行了预测，并采用SWISS-MODEL网络平台和Discovery Studio(DS) Modeling 1.1软件成功模拟了B2L蛋白3 D空间构象模型，遴选出3个可能性高的表位假定区域，用于后续2E4表位作图研究。.表位作图研究，首先针对2E4模拟表位基序进行生物淘选。采用噬菌体随机展示肽库技术获得10株阳性DNA突变体，通过测序、比对，推测表位基序为VKVNPPQYDLxx（x代表任意氨基酸残基）。第二，确定2E4表位的位置。根据B2L分子同源建模在线搜索结果，结合DNAStar预测数据，将B2L蛋白分为55aa、31aa以及38aa三个区段进行原核表达。通过验证，将2E4表位定位于55aa区段内。第三，确定表位结构类型。通过模拟表位与B2L序列比对，并结合间接ELISA和Western blot分析结果，确定2E4表位为构象型表位。第四，确定2E4表位关键性氨基酸残基。根据同源建模的3D模型，在表位相关区域内选择K61、K69、K75、D94、E95和L96共6个目标氨基酸，利用分丙氨酸扫描法构建突变重组质粒pGEX-6p-1-n（n代表6个不同位置的目标残基），表达，纯化，验证。结果发现D94A位置取代后，使 2E4与B2L蛋白反应能力显著下降，而其它氨基酸的替换对于B2L结合影响不明显，而共同突变K61A、E62A、D92A、D94A成丙氨酸后，使2E4与B2L蛋白反应几乎完全抑制，证明K61、E62、D92、D94均为2E4构象型表位的贡献残基，其中D94为2E4表位的关键性氨基酸。这些研究结果，不仅可以提供单克隆抗体在氨基酸水平上与其表位相互作用的关键数据，并为今后研制羊口疮基因工程表位疫苗奠定了基础。