宿主因子CypB促进羊传染性脓疱病毒复制的分子机制研究

The study on the critical host proteins involved in Orf virus (ORFV) infection helps to reveal its pathogenesis. Our previous study had demonstrated that Cyclophilin B (CypB) significantly contributed to ORFV replication. However, the mechanism of ORFV utilizing CypB to facilitate ORFV replication and infection is still not clear. Here, we determine the role of CypB at the early phage of ORFV infection by the construct of RNA interfere and over-expression plasmids of CypB gene, and the site-directed mutagenesis of CypB gene. The interacting proteins with CypB are identified by using Co-IP, MS analysis and GST-pull down assays, and the binding sites of CypB are predicted by bioinformatics analysis. The key amino acid residues are determined using the truncated interacting protein of CypB and the genetically modified CypB by Co-IP and GST-pull down methods, respectively. The molecular mechanism of CypB and the interacting protein are further clarified by the co-localization observation. The prospective results not only help us to understand deeply the pathogenic mechanism of ORFV, but also provide important theoretical basis for blocking ORFV infection by CypB pathway.

研究ORFV感染依赖的关键宿主蛋白是揭示其致病机制的一个重要突破口。前期研究证实，宿主因子CypB能够显著促进ORFV的复制。然而，目前尚不清楚该病毒是如何利用CypB促进其复制并完成侵染过程。为此，本项目拟利用RNAi、定点突变等技术探讨CypB的表达和结构改变对ORFV复制的影响，明确其在ORFV早期侵染过程中的作用；筛选鉴定出与CypB互作的病毒蛋白或蛋白质分子群，利用生物信息学手段分析可能结合靶位；构建CypB互作蛋白的截短体以及CypB蛋白的缺失突变体，利用Co-IP和GST-pull down等方法鉴定出在CypB及其互作蛋白上的关键结合域；利用激光共聚焦技术对CypB及其互作蛋白与ORFV进行共定位观察，进一步解析CypB及其互作蛋白在ORFV早期侵染过程中的作用及机制。预期结果不仅有利于全面揭示ORFV致病机制，而且可为利用CypB途径阻断ORFV感染提供重要的理论依据。

ORFV 可通过编码多个免疫调节蛋白对宿主免疫进行调节，进而逃避宿主免疫反应，然而当前对其介导的宿主免疫和致病机制的研究仍不够深入，从宿主角度出发，研究ORFV感染依赖的关键宿主蛋白成为揭示其致病机制的一个重要突破口。亲环蛋白B（CypB）被证实在ORFV早期感染宿主细胞中表达显著上调，且呈现显著促进ORFV增殖的能力。然而，ORFV如何利用宿主细胞CypB实现侵染的分子机制，目前尚不清楚。为此，本项目利用激光共聚焦、免疫电镜等技术检测CypB在ORFV感染宿主细胞中的定位分布，结果显示，CypB蛋白主要分布在感染宿主细胞的粗面内质网上。利用qPCR和Western blot分别从mRNA转录水平和蛋白水平对宿主蛋白亲环素B（CypB）在ORFV感染后的变化规律，完成对CypB在ORFV感染细胞中的定性和定量检测。利用CypB 酶功能缺失突变体、RNAi缺失CypB以及过表达CypB等方法，进一步证实CypB能够显著促进ORFV在宿主细胞中的增殖。构建多个携带HA标签的ORFV病毒蛋白真核表达质粒，利用Co-IP、GST pull-down及激光共聚焦等技术，成功筛选鉴定出CypB的互作病毒蛋白ORFV ORF058，并在构建一系列ORF058蛋白截短体的基础上，利用Co-IP鉴定出ORF058蛋白与CypB结合的关键区域为第52-55位氨基酸位点。随后，利用基因同源重组技术构建以绿色荧光蛋白（GFP）作为筛选标识的ORFV-SY17 Δ058基因缺失株，并成功拯救出携带红色荧光蛋白（RFP）的ORFV-SY17-RV058基因回复株，进一步解析ORF058蛋白在病毒入侵宿主细胞过程中的作用及机制。上述研究内容，从病毒宿主互作角度揭示CypB介导ORFV ORF058蛋白侵染宿主细胞的分子机制，其不仅有利于全面揭示ORFV致病分子机制，而且有望作为抗病毒药物分子的作用靶点。