类风湿性关节炎相关miRNA的鉴定以及血浆miRNA标志物的筛选与评价研究

Rheumatoid arthritis (RA) has complex genetic determination, but most of specific genetic/epigentic factors are unknown. This study will sequence miRNA and mRNA from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and miRNA from plasma for each subject using the Illumina Solexa in 40 RA cases and 40 controls, detect their corresponding expression profiles, identify significantly differential expressed miRNAs and set up PBMC association network of miRNA and RA as well as regulating network between miRNAs and their target mRNAs. This study will also screen RA-associated miRNA biomarkers from plasma. The detected biomarkers will be replicated the associations in another independent population (100RA vs.100 controls). Some molecular and cellular experiments (e.g., do the biomarkers have effects on the activation of T lymphocytes?) will be performed to detect the functional mechanism underlying the association between biomarkers and RA. The RA diagnostic value will be also evaluated for the identified miRNA biomarkers in another independent sample (200 RA vs. 200 controls), e.g., by ROC method. This study will systemically identify the RA associated miRNAs and evaluate their RA diagnostic values, which will improve the clinical diagnosis in RA and provide basic data for developing the methods and technologies of RA early diagnosis and intervention.

类风湿性关节炎（RA）受复杂的遗传调控，但目前大多数遗传/表观遗传因子并未明。本项目将在40例RA和40例对照中，采用Illumina Solexa分别测序各例的外周血单个核细胞（PBMC）中的miRNA和mRNA，以及血浆miRNA，建立相应的表达谱，鉴定显著差异表达的miRNA，构建PBMC中miRNA与RA关联网络，以及miRNA与靶mRNA的调控网络。同时，筛选RA相关的血浆miRNA生物标志物，在另一独立样本（100RA vs.100对照）中验证标记物，并进行miRNA对T淋巴细胞的活化影响等深入的RA相关细胞分子功能研究。然后,在独立大样本（200RA vs. 200对照）中用ROC曲线等评价其RA诊断价值。本项目可能系统地筛选RA相关的miRNA表观遗传因素及评价血浆miRNA在RA诊断中的作用，为提高RA的临床诊断水平和开发RA早期干预和预防的方法和手段提供基础数据。

类风湿性关节炎（RA）受复杂的遗传调控，但目前绝大多数遗传/表观遗传因子并未明。本项目收集了28例RA女性患者和18例女性健康对照的外周血，并分离外周血单个核细胞（PBMC），提取mRNA，用Affymetrix miRNA 4.0 和 lncRNA&mRNA Human Gene Expression Microarray V4.0检测miRNA和mRNA的表达谱。差异表达分析筛选得到16个差异表达的miRNA，结果显示该16个差异表达的miRNA均在RA中显著低表达，且能在分层聚类中把RA和正常组区分开。运用miRNA靶基因预测软件(TargetScan和miRDB)对筛选得到的16个miRNA进行靶基因的预测，其中被两种预测软件同时预测到的靶基因有9500个,计算miRNA与其对应靶基因的相关系数(r)，鉴定显著的负相关miRNA-mRNA对(r<-0.4,p<0.05 )，运用Cytoscape画图软件构建miRNA-mRNA调控网络。在另外的独立样本中，RT-PCR验证了has-miR-99b差异，而且运用ROC曲线评价miRNA生物标志物判别RA的灵敏度和特异度，结果显示miR-99b-5p的ROC曲线下面积为0.789(P=0.001)。进一步探讨miR-99b-5p 对RA的作用，构建了miR-99b-5p过表达株。CCK-8实验表明miR-99b-5p转染的 Jurkat T细胞与阴性对照相比增殖活性明显提高。流式细胞分析表明过表达miR-99b-5p显著降低了细胞凋亡率。过表达miR-99b-5p引起的细胞凋亡主要集中在G2/M期。miR-99b-5p过度表达能有效提高Jurkat T细胞活化程度。过表达miR-99b-5p显著升高IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-r。数据库预测和实验验证mTOR和RASSF4为miR-99b-5p靶基因。本项目培养了博士生2名和硕士生10名。该项目研究成果已发表SCI论文共计10篇，申请发明专利一项。本项目系统鉴定了RA 相关的表观miRNA 遗传因素及miRNA 在RA 诊断中的作用，发现miR-99b-5p可望作为RA早期诊断的生物标志物。本项目可进一步阐明和理解RA 的致病机理，为揭示RA 的遗传机理提供更深的认识,为提高RA 的临床治疗水平和开发RA 早期干预和预防的方法和手段提供基础数据。