淫羊藿苷在骨软骨修复中对钙化层重建的作用和机制

In the joint area, bone and cartilage form a complex object through mediation of calcified cartilage zone, in which they are relatively independent but influence each other. Therefore, reconstruction of functionalized calcified cartilage zone plays a vital role in protecting articular cartilage and subchondral bone during the repair of osteochondral defect. However, it is so far difficult to reconstruct bone-cartilage tissue with functionalized calcified cartilage zone by using tissue engineering technology. The natural product, icariin (Ica), has good promoting effect on osteogenesis，chondrogenesis and interface integration between neocartilage and subchondral bone. Ica also can regulate the directional differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) in mixed osteogenic and chondrogenic medium. Accordingly, in this application, Ica will be introduced into the scaffold as an accelerant by covalent bond. The effect of the stably released Ica on the differentiation of MSCs encapsulated in the scaffold in different microenviroment will be investigated. Then, the MSCs/scaffold construct will be implanted in the osteochondral defect and the promoting effect of Ica on neocartilage and subchondral bone will be studied. And we will focus on the interface integration between the host tissue and newly formed cartilage/bone, and discuss the effect and mechanism of Ica on the reconstruction of osteochondral interface—functionalized calcified cartilage zone. This study not only has potential to obtain osteochondral repair body with functionalized calcified cartilage zone, but also can extend the application of natural products.

在关节部位，骨和软骨之间通过钙化层的介导构成一个相互独立又相互影响的复杂整体。因此，在骨软骨损伤修复中，功能化钙化层的良好重建对保护软骨和软骨下骨起着至关重要的作用。然而，采用组织工程技术目前还难以重建出具有功能化钙化层的骨软骨组织。天然产物淫羊藿苷(Ica)在成骨、成软骨以及新生软骨与软骨下骨的界面整合中具有良好的促进作用，在成骨和成软骨诱导混合培养介质中能够调控骨髓间充质干细胞（MSCs）的定向分化，据此，本申请拟将Ica作为促进剂共价载入支架中，考察在不同微环境下支架中稳定释放的Ica对包裹于支架中的MSCs分化的影响，以及在将MSCs/支架复合构建物植入骨软骨缺损部位后，Ica对新生软骨和软骨下骨的促进作用，对新生骨和软骨与宿主组织的界面整合作用，以及在骨软骨界面-功能化钙化层重建中的作用和机制。该研究不仅有望获得具有功能化钙化层的骨软骨修复体，也将拓宽天然产物的应用范围。

由创伤和关节疾病引起的关节软骨损伤在临床上十分常见，而在软骨发生损伤时，还常常伴随着钙化层和软骨下骨的损伤。组织工程技术是目前治疗骨软骨损伤的有效方法钙化层是关节骨软骨之间的界面结构，具有重要的生理功能，其中的细胞受成骨和成软骨双重微环境以及生长因子的共同作用。已有研究表明，通过调整支架构型以及生长因子的种类和浓度，有望在体外构建出仿生钙化层。然而，生长因子具有价格昂贵、不稳定、可能具有潜在的免疫原性等问题。. 淫羊藿苷（Ica）是一种价格低廉、化学性质稳定、具有促成骨和成软骨活性的小分子物质。因此，本项目将Ica作为促进剂载入透明质酸/胶原复合水凝胶（Ica-HA/Col）中，考察了在成骨/成软骨混合诱导培养条件下水凝胶支架中稳定释放的Ica对包裹于凝胶中的兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化的影响，以及在将BMSCs/水凝胶复合构建物植入骨软骨缺损部位后，Ica对新生软骨和软骨下骨的促进作用，对新生骨和新生软骨与宿主组织界面的整合作用，以及在功能化钙化层重建中的作用。. 本项目首先将BMSCs包裹在HA/Col水凝胶中，考察了水凝胶中的BMSCs在含有不同浓度（2.5µM、5µM和10µM）Ica的成骨/成软骨混合诱导介质中的分化情况。结果发现Ica在5-10µM的浓度范围内可能更能促进BMSCs同时向成骨和成软骨方向分化，促进类似于钙化层特征基质的沉积。. 随后，对Ica进行化学修饰，制备出巯基化淫羊藿苷（Ica-SH），考察了Ica-SH的细胞相容性和生物活性。结果显示，制备的Ica-SH具有良好的细胞相容性、生物活性和可控释放行为，有望用于构建生物活性良好的组织工程支架以促进骨软骨界面的修复。. 最后，将BMSCs包裹在Ica共价修饰的水凝胶（Ica-HA/Col）中，考察了BMSCs在不同诱导培养介质中分化的情况。同时，将BMSCs/Ica-HA/Col水凝胶复合构建物植入兔膝关节骨软骨缺损部位，发现植入1个月后，缺损部位完全被新生组织填充，新生软骨与天然软骨界面整合良好，骨软骨界面形成了不完整的潮线结构；3个月后，新生软骨与天然软骨相似，新生骨和软骨与宿主组织界面整合良好，然而，骨软骨界面处未发现明显的潮线结构。后续研究中需要进一步优化凝胶中的载药量以期达到稳定钙化层的形成。