基于骨软骨界层结构在体重建成骨和成软骨微环境诱导BMSCs定向分化实验研究

透明软骨与软骨下骨微环境差异显著，其间的界层结构一旦发生损伤，将导致骨髓腔与关节腔相通，骨与软骨微环境发生紊乱。鉴于微环境稳定是保持细胞正常增殖、分化、代谢和功能活动的重要条件，在前期研究界层结构的基础上，我们提出"利用界层结构为植入的骨髓间充质干细胞（BMSCs）重建成骨和成软骨微环境，实现其定向分化再生修复骨软骨缺损"新理念。本项目拟在初步研制"透明软骨-界层结构-软骨下骨"仿生一体化支架前提下，建立猪膝关节骨软骨缺损模型，将绿色荧光蛋白标记的BMSCs接种于支架并植入缺损；以无界层结构组为对照，通过对成骨和成软骨微环境中关键因素对比分析，阐明本策略重建微环境的可行性；通过对再生修复组织质量检测，阐明界层结构对微环境重建的必要性；通过对BMSCs生物学行为观察，探讨不同微环境对BMSCs增殖、分化及转归的影响机制。本项目将为组织工程技术再生修复关节骨软骨缺损提供理论依据和技术支持。

透明软骨与软骨下骨微环境差异显著，其间的界层结构一旦发生损伤，将导致骨髓腔与关节腔相通，骨与软骨微环境发生紊乱。鉴于微环境稳定是保持细胞正常增殖、分化、代谢和功能活动的重要条件，在前期研究界层结构的基础上，我们提出“利用界层结构为植入的骨髓间充质干细胞（BMSCs）重建成骨和成软骨微环境，实现其定向分化再生修复骨软骨缺损”新理念。本项目研究重点在于阐明体重建微环境的可行性和必要性，探讨不同微环境对BMSCs增殖、分化及转归的可能影响机制。项目获得批准后，项目负责人积极组织项目组成员进行开题论证，并按照计划书内容进行分工。截止2013年12月份，已经按计划完成任务书所有研究内容，取得研究成果包括：建立贵州小香猪BMSCs分离、培养及鉴定方法，抽取20ml骨髓体外培养1周即可获得2×108个BMSCs，纯度达95%以上。制备出含天然“界层结构”骨软骨仿生支架，支架为圆柱状，直径8mm，软骨层厚2mm，软骨下骨厚5mm；软骨层孔隙率为91.1±3.8%，孔径为79.7±17.1µm；软骨下骨孔隙率为73.5±2.6%，孔径为470.2±158.8µm；界层结构无孔隙。将BMSCs以适宜密度接种于支架后进行体内植入，术后24周证实有界层结构组骨软骨缺损修复完整，修复组织的形态结构和组织成分与正常骨软骨相似；无界层结构组软骨区的修复组织主要为纤维软骨，软骨下骨修复完整；空白对照组基本未修复。O’Driscoll组织学评分：空白对照组5.5±0.52；无界层结构组14.2±0.68；有界层结构组18.8±0.87。BMSCs在体生物学行为研究结果表明修复组织的细胞均可被GFP和Brdu免疫组化染呈绿色荧光和红色荧光，证实细胞来源于体外植入，在体内增殖并分化形成软骨细胞。微环境分析结果表明正常关节液氧分压为7.5±0.36mmHg，骨髓液氧分压为50.6±1.23 mmHg，两者差异显著（P<0.01）。术后12周和24周各组关节液和骨髓液的氧分压均无显著变化。正常关节腔压力为-12±2.2 mmH2O，骨髓腔压力为14±1.5 mmH2O，术后12周，各组关节腔压力均有不同程度增高，空白对照组关节腔压力增高最明显为-5±1.9 mmH2O，有界层结构组增高最低约为-10±1.5 mmH2O；各组髓腔压力均显著高于正常组（P<0.01），但组间无差异。术后24周，有界层结构组关节