三疣梭子蟹增殖放流分子标志方法研究及其效果评价

As a kind of commercially important portunid crab, the swimming crab Portunus trituberculatus are widely distributed in the Pacific and Indian oceans. Aiming at promoting coastal fisheries exhausted by overfishing, the Chinese government started the marine stock enhancement programme of P. trituberculatus in recent years.However, no available methods are established to evaluate the effectiveness of released crab for stock enhancement. The difficulty lies in that the crab must take off the carapace many times in the process of growth, so the phisical or chemical markers would be losed or block their normal growth, when the crabs taking these markers are released into the sea. In order to solve this problem, we expect to build a high- through-put testing method to evaluate the effectiveness of stock enhancement for P. trituberculatus, based on SSR (Simple sequence repeat) and mt SNP (Mitochondrial single nucleotide polymorphism) markers.We will also try to build a recapture stock assessment model based on the molecular makers. Additionally, using the methods, we will appraise the efffectiveness of stock enhancement for P. trituberculatus in Haizhou port which will be the first time as the aimed place of stock enhancement for the crab, and further study the influence of releasing crabs on genetic polymorphism of wild population.

为应对海捕渔获量大量下降，我国对三疣梭子蟹增殖放流活动逐年增加。但该蟹多次脱壳生长的特殊生活史限制了目前各物理、化学标志方法的应用，故无法对增殖放流效果进行有效评估。为解决此难题，项目组拟组合微卫星和线粒体SNP标记建立一套三疣梭子蟹增殖放流效果评估的标志方法及相应的基于分子标志评估放流效果的数学模型。项目首先在开发分子标记基础上，摸清各种标记及其多态性在有效识别放流家系上的能力，进而组合线粒体SNP标记（HRM检测）和微卫星标记（多重PCR技术）构建可高通量检测放流个体的方法；进一步在封闭空间内模拟放流情况验证该方法的识别能力，根据实测数据构建一个数学评估模型。在此基础上，结合海州湾初始实施三疣梭子蟹增殖放流活动，对海州湾实施放流前后该蟹的种质遗传多样性进行分析，建立放流亲本遗传信息库。本研究结果将丰富三疣梭子蟹增殖放流的基础理论，为科学指导放流提供依据。

为应对自然海区三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）海捕渔获量下降的趋势，我国近年来对该蟹的增殖放流活动逐年增加，如何评估增殖放流效果成为继续加强该蟹增殖放流活动的关键。作为甲壳类，其一生多次脱壳才能生长的特性限制了至今已知的大多数物理和化学标记法的应用。为解决此难题，项目组开展了如下工作：.1. 基于三疣梭子蟹线粒体全基因组序列，以步行法设计了179对引物，利用高分辨率熔解曲线（HRM）结合测序，确定了三疣梭子蟹线粒体基因组中的24个SNP位点，获得这些位点的分布频率及位置特征。.2. 利用小片段扩增法，建立了三疣梭子蟹线粒体基因组24个SNP位点的高通量HRM检测方法。进一步利用HRM技术，研究探讨了这些SNP位点在增殖放流的三疣梭子蟹家系识别上的应用，成功区分了4个家系。.3. 利用重亚硫酸盐测序法，对适于三疣梭子蟹线粒体基因组甲基化分析的BSP（Bisulfite sequencing PCR）引物进行了筛选，在设计的21对引物中，获得了12对BSP引物，并利用这些引物对三疣梭子蟹不同地理群体的甲基化特征进行了验证，揭示了莱州湾群体和海州湾群体线粒体基因组本底水平上的甲基化特征存在一定差异。.4. 建立一种基于mt SNPs分子标记三疣梭子蟹增殖放流效果评估的数学模型，该模型以增殖放流个体的分布及回捕概率为正态分布的假设为前提，建立了回捕期望值及总回捕量的公式。通过模拟验证，进一步证实了该模型的实用性。.5. 利用mtDNA-SNP标记对2010年和2018年黄渤海沿岸的丹东群体、莱州湾群体、海州湾群体和舟山群体的三疣梭子蟹遗传多样性组成情况进行了分析，揭示了受增殖放流影响，三疣梭子蟹群体间遗传变异增大，群体内遗传变异减少的现象。据此我们建议，在继续开展的三疣梭子蟹增殖放流活动时，应该注重增加放流亲本的数量。