TRAF6信号途径在骨髓瘤中的表达和作用机制

Cytokines in the microenvironment affect the survival of myeloma cells through signaling pathways. Our preliminary experiments showed that the joint factor TRAF6 was highly expressed in MM cells, SiTRAF6C can inhibit MM cells' proliferation and induce apoptosis. Nonetheless, the role of TRAF6 pathway in myeloma cells is not yet in-depth study. In addition, the role of TRAF6 pathway are recognized critical in monocytes and osteoclasts, which are both important in myeloma. This topic use WB, PCR to observe expression of TRAF6 and its possible upstream factors in myeloma cells, use co-immunoprecipitation to observe recruitment of TRAF6 by stimulation of cytokines, use SiRNA to observe proliferation and apoptosis of cells, use repoter gene analysis to find the possible transcription factor of TRAF6, build co-cultured system structures of MM cells and osteoclasts to observ the role of TRAF6 in the co-cultured system. The subjet is designed to study the biological role and mechanism of TRAF6 signaling pathway in MM cells, to explore the importance of TRAF6 pathway in MM microenvironment, which may provide a theoretical basis of new "targeted" theraputic strategy for MM.

微环境中细胞因 子通过信号途径影响骨髓瘤细胞的生存。我们的前期试验表明MM细胞高表达接头因子TRAF6，SiTRAF6C能抑制MM细胞增殖及诱导凋亡，但TRAF6途径在骨髓瘤细胞中的作用尚无深入研究。另外，在骨髓瘤中单核细胞及破骨细胞地位重要，而公认其中TRAF6途径作用关键。本课题采用WB、PCR观察TRAF6及其可能的上游因子在骨髓瘤细胞中的表达，免疫共沉淀观察细胞受刺激后TRAF6的招募情况，SiRNA观察TRAF6及其可能的上游因子对细胞的作用，报告基因法寻找TRAF6可能的转录因子，搭建MM细胞和破骨细胞共培养体系观察TRAF6在共培养体系的作用，由此探讨TRAF6信号途径对MM细胞的生物学作用及机制，及TRAF6途径在微环境中的重要性，为同时针对微环境和MM细胞的"多靶向"治疗理念提供理论基础。

多发性骨髓瘤（MM）是骨髓中异常浆细胞过度增殖的恶性肿瘤，目前不能治愈。其骨髓微环境可分泌细胞因子或直接接触启动MM的多种信号途径，诱导恶性克隆增殖。肿瘤坏死因子受体相关因子6 (TRAF6) 是一个独特的接头蛋白，可介导多种信号，作为细胞内信号传导通路的一个开关，在骨髓瘤微环境中可能存在很多TRAF6的刺激因子。 . 本研究检测TRAF6在MM细胞系中的表达水平；构建SiTRAF6C检测转染后骨髓瘤细胞的增殖和凋亡水平；观察TRAF6与患者临床指标的相关性，观察基质细胞与骨髓瘤细胞共培养后TRAF6的情况。观察rhBLyS刺激RPMI8226细胞系后，TRAF6蛋白的表达情况及TRAF6蛋白泛素化水平；TRAF6C siRNA转染转染细胞后，NF-κB途径各蛋白的表达情况及细胞活力情况。检测MM细胞系、MM患者外周血单个核细胞（PBMCs）中的中RANK的定位；核因子受体活化因子配体（RANKL）作用于RPMI8226细胞后，TRAF6、NF-κB途径各蛋白的表达。. 研究发现TRAF6在骨髓瘤细胞的表达水平增高，TRAF6C siRNA转染组细胞增殖下降（p<0.01），凋亡率增加（p<0.01）。TRAF6与患者β2M成正相关（p<0.01），与白蛋白成负相关（p<0.01）。骨髓基质细胞与各骨髓瘤细胞株共培养能促进其TRAF6表达。rhBLyS刺激下RPMI8226细胞TRAF6蛋白表达明显升高；p-p65及p-p100在30 min左右蛋白表达水平明显升高，TRAF6泛素化水平增加；TRAF6C siRNA转染后p-p65及p-p100表达水平明显降低，而rhBLyS促细胞增殖作用明显减弱。MM细胞株RPMI8226、KM3、U266、JJN3及MM患者骨髓瘤细胞中均有RANK的表达；RANKL刺激下RPMI8226细胞TRAF6表达增强，经典和非经典途径均被激活。TRAF6C siRNA转染细胞后，p-p65及p-p100蛋白表达水平明显降低，干扰TRAF6能够抑制RANKL对骨髓瘤细胞的增殖。 .结论 TRAF6在基质细胞、BLyS、 RANKL/RANK介导NF-κB经典途径和非经典途径中起调控作用，探讨TRAF6对骨髓瘤发病机制水平上的治疗研究有益。