益气小复方对三阴性乳腺癌MDR的逆转及机制探讨

This research is based on the "Yiqi Fuzheng" principle of traditional Chinese medicine(TCM) on breast cancer,according to the the prestigious doctor's clinical experience and our previous research results.The prescription is composed of Astragalus mongholicus and Codonopsis pilosula on the behalf of "Yiqi Fuzhen"principle.Multidrug resistance(MDR) in triple negative breast cancer(TNBC)is common and difficult to deal with. To observe the Yiqi prescription on the reverse of MDR,the establishment of MDR in vivo and in vitro is needed.On the level of the cellular and molecular,we will use the following measurements:gene chip detection,pattern recognition,virus transfection,HPLC detection,biological optical detection techniques.Considering ATP-binding cassette and signal transduction pathways,we will explore the reversal mechanisms of Yiqi prescription.By siRNA and gene knockout,we further verify the key targets of MDR reversal mechanisms, thus we can provide the experimental basis for the clinical use of "Yiqi Fuzheng" principle on the reverse of TNBC MDR.

本课题基于中医益气扶正法治疗乳腺癌的理论，结合全国名中医陆德铭教授长期临床经验和课题组前期实验研究结果，以益气扶正法代表药物黄芪和党参组成益气小复方，选择临床预后不良的三阴性乳腺癌为研究对象，从该亚型常见的化疗多药耐药（MDR）的临床难题着手，通过建立体内、体外三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231 MDR模型，观察益气小复方逆转MDR的作用。在细胞和分子水平采用基因芯片检测、模式识别分类方法、慢病毒转染、高效液相检测、生物发光学检测等技术，从ABC转运蛋白的胞吐和信号转导通路异常介导的MDR两个途径探讨益气小复方逆转MDR的作用机制，并通过siRNA干扰和基因敲除法沉默靶基因，进一步验证益气小复方逆转三阴性乳腺癌MDR的关键靶点，从而明确益气小复方逆转MDR的作用机制，为益气扶正法逆转三阴性乳腺癌MDR的临床实践提供实验依据。

本课题组采用持续诱导法建立了三阴性乳腺癌多药耐药细胞株MDA-MB-231/DDP，对其进行耐药性鉴定，结果发现该耐药细胞株对诱导耐药的DDP药物具有中度耐药，且对与DDP化学结构、作用途径不相同的其他化疗药物如5-氟尿嘧啶及环磷酰胺等也具有一定程度的耐药性，符合多药耐药细胞株构建标准。该细胞株的耐药相关基因（MDR1、BCRP、GST-π、MMP7）、转运蛋白超家族成员P-gp、BCRP和MRP2均呈现高表达。.采用基因芯片的检测方法对亲本细胞株MDA-MB-231 和耐药细胞株MDA-MB-231/DDP 细胞进行了全基因谱扫描，共筛选出895个差异基因。通过生信分析和检索文献最终锁定mRNA ETS1和Akt，作为其发生耐药的潜在靶点。.通过转染技术siETS1，发现该耐药细胞株的耐药特性降低，NF-κB的核扭转现象减少。通过免疫共沉淀和双荧光素法证明了ETS1和NF-κB中的IKKα之间存在交联，高表达ETS1通过上调IKKα增强了NF-κB核扭转现象，以促进转运蛋白ABC超家族成员P-gp、BCRP和MRP2上调，从而引起耐药。.研究结果发现益气小复方具有逆转MDA-MB-231/DDP耐药性的作用，通过多靶点降低对p-Akt以及IKKα/NF-κB通路等相关蛋白的下调，进一步下调了转运蛋白超家族成员P-gp、BCRP和MRP2等表达水平，实现逆转耐药发挥协同增效的作用。.本研究为益气扶正法在三阴性乳腺癌晚期耐药的治疗方面提供了科学数据，也为其他类型的耐药研究，提供了前期研究基础。