益气小复方逆转HER2过表达亚型乳腺癌曲妥珠单抗耐药的机制研究

The prognosis of HER2 over expression breast cancer is poor.Although Trastuzumab improves survival outcomes in patients with HER2+ breast cancer,trastuzumab resistance is the biggest challenge. The PI3K/AKT/mTOR intracellular signalling pathway is always activated in HER2 overexpression breast cancer and associated with Trastuzumab resistance. We have found Yiqi Formula dowregulat PTEN,and up-regulat p-AKT1 expression in the PI3K/AKT pathway.To observe the Yiqi Formula on the reverse of trastuzumab resistance,the establishment of model in vivo and in vitro is needed.On the level of the cellular and molecular,we will use the following measurements: Western blot,RTqPC,RNAi, biological optical detection techniques. We will explore the reversal mechanisms of Yiqi Formula By siRNA and gene knockout,we further verify the key targets of reversal mechanisms, thus we can provide the experimental basis for the clinical use of “Yiqi Fuzheng”principle on the reverse of trastuzumab resistance.

HER2过表达乳腺癌作为一类预后差的分子亚型，虽然Trastuzumab使其治疗取得了突破性的进展，但耐药问题仍是目前面临的最大挑战。PI3K/AKT/TOR通路过度活化是Trastuzumab耐药的重要机制。我们在前期研究中发现，益气小复方能下调乳腺癌p-AKT、上调PTEN表达。基于以上基础，通过建立体内、体外该亚型Trastuzumab耐药模型，观察益气小复方对Trastuzumab耐药的影响；并进一步从PI3K/AKT/mTOR通路着手，综合采用Western blot、RTqPCR、RNAi、生物发光学检测等技术，探索益气小复方逆转HER2过表达亚型乳腺癌Trastuzumab耐药的关键靶点基因，从而揭示其逆转Trastuzumab耐药的作用机制，为益气扶正法治疗Trastuzumab耐药的HER2过表达亚型乳腺癌的临床实践提供实验依据。

本课题立足于扶正固本治疗乳腺癌的理论，以扶正代表药物黄芪和党参组成益气小复方作为研究对象，在课题组既往十余年的研究基础上，对临床预后不良的Her-2过表达型乳腺Trastuzumab耐药问题，探讨中医益气扶正方逆转耐药的机制之一。以期为临床运用益气扶正治疗Trastuzumab耐药的Her-2乳腺癌提供实验依据。首先，我们采用益气小复方水提醇沉和血清药理学两种方法制备益气小复方水提醇沉剂和大鼠药物血清，分别以靶向药物厄洛替尼（特罗凯）和拉帕替尼（泰克布）为对照组及联合运用，对益气小复方作用于MDA-MB-231及SK-BR-3细胞的增殖、凋亡及细胞周期的影响进行研究。结果发现：两种给药都能抑制上述两种乳腺癌细胞的增殖，可以诱导细胞G1期监控，促进细胞凋亡。考虑到中药复方用于体外实验的局限性，我们对益气小复方进行了质量控制和成分检测，最终使用冻干粉（类似化合物）这一更符合现代实验的形式。其次，我们建立并鉴定了Trastuzumab耐药细胞株，SK-BR-3/R，我们采用益气小复方干预敏感株和耐药株，发现小复方能增加Trastuzumab的敏感性，能下调p-HER2、p-Akt、上调PTEN蛋白表达水平。提示小复方作用的机制与该条通路有关。那么益气小复方具体的基因层面的机制是什么？靶点是什么？为了继续深入探讨，我们观察了乳腺癌细胞株的miR221水平，发现耐药株中的miR221水平明显高于敏感株，耐药株中的PTEN水平低于敏感株中的PTEN水平。是否miR221作用于PTEN是益气小复方逆转Trastuzumab耐药的机制之一？我们通过建立miR221稳转的细胞株，观察到PTEN蛋白表达水平降低，miR221抑制剂干预后,PTEN表达水平上升。对HER2亚型乳腺癌细胞株转染PTEN后，细胞株对HER2通路的敏感性增强。HER2通路相关癌蛋白表达水平也从证实了miR221对PTEN的调控机制。在体内实验方面，对裸鼠第二队乳房垫注射Trastuzumab耐药细胞株，观察到益气小复方能增加Trastuzumab的敏感性，联合用药组的肿瘤生长较其他组缓慢，具有一定的抑瘤作用。.根据体内与体外实验结果认为益气小复方对er-2过表达型乳腺癌的抑制作用可能是通过miR221-PTEN-Akt来实现的。