益气小复方及其成分配伍对乳腺癌Akt磷酸化的调节

本课题根据扶正固本治疗乳腺癌的理论，结合名老中医长期临床经验和前期研究结果，以扶正代表药物黄芪和茯苓组成益气小复方，探讨黄芪与茯苓及其成分的最佳配伍比例；选择临床预后不良的Basal-like型和Her-2过表达型乳腺癌为研究对象，观察益气小复方对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响；从与乳腺癌发展、复发、转移和耐药密切相关的蛋白激酶B(Akt)着手，以p-AKT和抑制AKT磷酸化的抑癌基因（PTEN、SHIP、PP2A和PHLPP）为主要指标，寻找益气小复方及其成分抑制乳腺癌的分子靶点；再采用siRNA干扰技术沉默靶基因来确认作用靶点，又采用激光共聚焦扫描显微镜技术观察Akt蛋白从细胞质转移到细胞膜上而被活化的具体过程，从而明确益气小复方抑制Akt磷酸化的关键环节，探讨益气小复方配伍作用特点和抑制乳腺癌的机制，为临床治疗提供有价值的实验依据。

本课题立足于扶正固本治疗乳腺癌的理论，以扶正代表药物黄芪和茯苓组成益气小复方作为研究对象，对临床预后不良的Basal-like型和Her-2过表达型乳腺癌开展了一系列的研究：首先，通过正交试验设计并采用高效液相色谱的检测方法寻找最优化的制备益气小复方的工艺，运用基线等比增减设计的方法筛选出黄芪与茯苓的最佳配比为10:6；接着，采用上述优化后的水提醇沉和血清药理学两种方法制备益气小复方水提醇沉剂和大鼠药物血清，分别以靶向药物厄洛替尼（特罗凯）和拉帕替尼（泰克布）为对照组及联合运用，对益气小复方作用于MDA-MB-231及SK-BR-3细胞的增殖、凋亡及细胞周期的影响进行研究，并从与乳腺癌发展、复发、转移和耐药密切相关的PI3K/Akt通路着手，寻找益气小复方抑制乳腺癌的分子靶点。研究结果发现：益气小复方水提醇沉剂和药物血清均能抑制上述两种乳腺癌细胞的增殖，可以诱导细胞G1期监控，促进细胞凋亡，且益气小复方水提醇沉剂能下调MDA-MB-231及SK-BR-3细胞p-EGFR、p-Akt1蛋白水平，增加抑癌蛋白PTEN表达水平。益气小复方药物血清联合靶向药物特罗凯和拉帕替尼能降低肿瘤细胞的侵袭能力。在体内实验方面，通过对Basal-like型乳腺癌移植瘤模型裸鼠的研究，也得到了与体外实验相同的结果；然后，采用siRNA干扰技术沉默PTEN靶基因及Akt抑制剂MK-2206与益气小复方水提醇沉剂的协同效应研究来确认作用靶点。根据体内与体外实验结果认为益气小复方对Basal-like型和Her-2过表达型乳腺癌的抑制作用可能是通过PI3K/Akt信号通路中抑癌基因PTEN和癌基因Akt1、EGFR的平衡实现的，且益气小复方提高靶向药物特罗凯和拉帕替尼的作用也可能通过上述机制实现；最后，为了明确益气小复方中发挥抗肿瘤作用的具体成分，又对益气小复方君药黄芪中有效成分芒柄花素及黄芪多糖进行了研究，发现芒柄花素和黄芪多糖同样能够通过抑制PI3K/Akt 信号转导通路来发挥抗肿瘤作用。