CDR1、CDR2、MDR1基因在香莲方逆转白念珠菌菌株对氟康唑耐药的作用研究

In recent years, Vulvovaginal and cutaneous candidiasis caused by Candida albicans rise sharply. Fluconazole resistance is one of the most important reason for it. Efflux pump, which exists on Candida albicans membrane, is a direct result of antifungal drugs in fungal membrane cell aggregation for fluconazole resistance. Xianglian compand, a kind of traditional Chinese herb medicine, which created and developed by researchers , has showed good effect on candida albicans infections, even though on fluconzole resistant strains over the years , some experiments also showed it. And our previous study showed that, Xianglian compand is likely to adjust the Candida albicans resistant membrane efflux pump ABCT and MFS family genes (CDR1, CDR2, MDR1) expression, thereby reversing fluconzole resistance in Candida albicans. Therefore, the project intends to build resistance gene knockout strains of Candida albicans, to detect CDR1, CDR2, MDR1 by RT-PCR and flow cytometry transition, after Xianglian compand and their main ingredient clove ( ethanol extract , eugenol ) , berberine ( ethanol extract , berberine ) effect, to prove Xianglian compand and its main ingredient reverse fluconazole resistance of Candida albicans.

近年，外阴及皮肤白念珠菌感染急剧上升，氟康唑耐药是最重要原因之一。白念珠菌细胞膜上存在着多种外排泵，直接导致抗真菌药物在白念真菌细胞内聚集的减少是最重要的影响机制。申请人研发的中药香莲方，多年来已经在抗白念株菌疗效方面得到临床验证，药敏实验等方面也得到证实。课题组的前期研究还表明，中药香莲方很可能是通过下调耐药白念珠菌细胞膜上外排泵ABCT和MFS家族基因（CDR1、CDR2、MDR1）表达，从而逆转白念珠菌耐药并恢复对氟康唑的敏感性。故本项目拟构建耐药白念珠菌基因敲除株，通过香莲方及其主要成分丁香（乙醇提取物、丁香酚）、黄连（乙醇提取物、黄连素）诱导白念珠菌耐药菌株向敏感菌株转变，用RT-PCR及流式细胞术检测转变过程中外排泵基因CDR1、CDR2、MDR1的表达，阐明香莲方及其主要成分下调CDR1、CDR2、MDR1基因逆转白念珠菌对氟康唑的耐药性。

氟康唑耐药是外阴及皮肤白念珠菌感染急剧上升的重要原因。白念珠菌细胞膜上存在的多种外排泵直接导致抗真菌药物在白念珠菌细胞内聚集的减少是最重要的影响机制。申请人研发的中药香莲方，多年来已经在抗白念株菌疗效方面得到临床验证。本项目采用香莲外洗液、丁香酚、小檗碱和丁香酚、小檗碱的混合液分别连续诱导培养白念珠菌标准耐药菌株CA17和临床分离耐药菌株，观察上述诱导药物对耐药白念珠菌的逆转耐药作用，比较各组诱导药物之间的作用差异。采用荧光定量RT-PCR检测耐药原代菌株和其成功逆转耐药的各敏感子代的外排泵基因CDR1、CDR2和MDR1表达水平的变化，并采用流式细胞术检测耐药原代菌株和其成功逆转耐药的各敏感子代外排荧光染色剂罗丹明6G（R6G）功能的变化，探讨香莲外洗液、丁香酚、小檗碱对外排泵蛋白功能的作用。此外，项目组还探讨采用高分辨熔解曲线方法鉴定常见致病性假丝酵母菌的方法和适宜反应体系。结果表明，香莲外洗液、丁香酚、小檗碱以及丁香酚和小檗碱的混合液对临床分离耐药菌株均具有逆转耐药作用，以香莲外洗液出现逆转的代数最早。经香莲外洗液、丁香酚、小檗碱以及丁香酚和小檗碱的混合液诱导培养，可以显著降低白念珠菌临床耐药菌株的CDR1、CDR2、MDR1三种外排泵相关的耐药基因表达水平，并明显抑制其编码的外排泵蛋白的外排功能。表明香莲外洗液中的包括丁香酚和小檗碱在内的部分有效成分可能是通过降低外排泵基因表达从而抑制真菌细胞外排抗真菌药物达到抗耐药作用的。在抑制外排泵基因表达和外排泵蛋白功能方面，香莲外洗液原方作用均强于两个中药单体的单独作用，但部分情况下接近两个单体的混合液的作用，表明丁香酚、小檗碱在香莲外洗液中有相互协同的抗耐药作用，香莲外洗液中其他成分的上述作用有待进一步验证。