基于TLR4信号通路研究青蒿-鳖甲药对配伍治疗狼疮性肾炎的机制

The Qinghao-Biejia Herb Pair is a key group for treating Lupus nephritis (LN） in traditional Chinese medicine. TLR4 is a receptor directly related to inflammatory and immune response and it is also a drug target for treating LN. It was reported that some active components of Qinghao can inhibit the TLR4 signaling pathway. The objective of this study is to determine whether LN can be relieved by Qinghao-Biejia Herb Pair through TLR4 signaling and clarify the compatibility mechanism. We will use MRL/lpr mouse and RAW264.7 cell line to observe the effect of the Qinghao-Biejia Herb Pair on both LN disease and TLR4 signaling. UPLC-ESI-MS will also be used to determine the components of Qinghao-Biejia Herb Pair absorbed in rat blood. And by using HEK-Blue™ mTLR4 cell line, we will screen out the active components which can affect the TLR4 signaling. Finally, the compatibility mechanism of Qinghao-Biejia Herb Pair will be explored by analyze the changes of these active components in the blood. This study will clarify the molecular mechanisms of the compatibility characters of the traditional Chinese herb pair. It is not only helpful for better understand the scientificalness of traditional Chinese medicine but also provide clues for finding new drugs.

青蒿-鳖甲药对是治疗狼疮性肾炎（LN）的传统中药复方中的核心药对。TLR4是与机体炎症、免疫反应直接相关的受体，也是抗LN药物作用的靶点。文献报道青蒿活性成分对TLR4受体通路有抑制作用。为进一步明确青蒿-鳖甲药对是否通过影响TLR4通路治疗LN以及该药对的配伍规律，本研究拟采用MRL/lpr狼疮鼠和RAW264.7小鼠巨噬细胞系，在整体和细胞水平观察青蒿-鳖甲药对配伍治疗LN的优势及对TLR4信号通路的作用特点，探讨青蒿-鳖甲药对在药效学上的配伍规律。在此基础上，用UPLC-ESI-MS技术确定青蒿-鳖甲药对入血成分，并用HEK-Blue™ mTLR4细胞筛选出能影响TLR4信号通路的活性成分。通过分析这些活性成分在体内含量的变化，探讨青蒿-鳖甲药对在药动学上的配伍规律。本研究在分子水平探讨药对配伍规律，这不仅有助于更深入理解传统中医药理论的科学性，还能为发现新型药物提供思路。

“解毒祛瘀滋阴方”是用于治疗系统性红斑狼疮（SLE）及狼疮性肾炎（LN）的经验方。青蒿-鳖甲药对是传统中药方剂中的经典药对，也是“解毒祛瘀滋阴方”中的核心药对。本课题以青蒿-鳖甲药对为研究对象，比较了青蒿、鳖甲单味药以及两药配伍后治疗狼疮性肾炎的效果、对TLR4通路的抑制作用、含药血清TLR4通路抑制作用及活性成分。研究结果表明，青蒿与鳖甲配伍使用与单独给药比较能明显增强对LN的治疗效果。具体表现为使MRL/lpr 狼疮鼠的尿蛋白量、血尿素氮水平及血清dsDNA水平都明显下降；减轻狼疮鼠脾脏、淋巴结肿大，其中对淋巴结的抑制作用特别显著（p < 0.001）；能减少肾组织免疫复合物及C3补体沉积；影响脾脏淋巴细胞T细胞分型，包括使CD8+、CD4+ T细胞增加，未分化的T细胞减少，在CD4+ T细胞中与炎症反应密切相关的Th1比例减少、 Treg比例增加。此外本研究结果还表明青蒿鳖甲配伍使用能加强对狼疮鼠肾组织及脾脏淋巴细胞、巨噬细胞TLR4通路的抑制，通过MyD88分支上IRAK、NF-κB、MAPK等分子的抑制使炎症因子释放减少。含药血清UPLC-MS分析结果表明，青蒿鳖甲药对入血主要成分为东莨菪内酯、青蒿乙素、青蒿素。此外，我们的拓展研究还表明青蒿、鳖甲单味药以及青蒿鳖甲联合配伍给药对狼疮鼠肠道菌群都有影响。肾脏组织基因转录组检测表明，青蒿鳖甲药对给药后狼疮鼠肾组织mRNA表达发生改变的基因数远远多于青蒿或鳖甲单独给药。本研究明确了青蒿鳖甲联合使用不是通过改变入血活性成分而是通过增强对TLR通路的抑制在药效学上起到配伍增效作用。狼疮鼠肠道菌群研究和肾脏转录组研究还提示，青蒿鳖甲的配伍还存在多种作用机制，这为今后进一步的研究及全面理解青蒿鳖甲的配伍作用提供了新的思路。