“青蒿-鳖甲”药对通过HIF1α-miR-124-P4HA1信号通路抑制肝癌细胞增殖与生长的研究

Artemisia apiacea-turtle shell drug pairs (ATD) were selected to be studied for their antitumor effect based on their significance revealing by literatures reviewing and clinical investigation. Individual and combined chromatography chemical features of the two medicines will be profiled through capillary electrophoresis mass spectrometry analysis. Representative active components of ATD (such as artemisinin and its derivatives) will be applied to tumor-burden nude mice and cells with HIF1a, miR-124 and P4HA1 genes silencing using siRNA tactic. The three corresponding gene expression and protein levels will also be evaluated to discuss the mechanism roles and biological significance of HIF1α-miR-124-P4HA1 (H124P)pathway in view of tumor suppression. Capillary electrophoresis-mass spectrometry will be employed to profile the metabolome difference of cells with or without treatment of using active components in ATD. Simultaneously, biofluids of serum and urine and tumor tissues from tumor burden mice will also subjected to metabolomic analysis individually. Finally intracellular artemisinin distribution will be traced through biotin labeling. At the levels of animals, cells and molecules, we want to explain the relationship among ATD, the derivatives of artemisinin and H124P pathway and the antitumor roles of hydroproline metabolism potentially regulated by ATD. The aim of the study is to help provide objective proof to support the scientific basis of Traditional Chinese Medicine prescription and to facilitate the new drug target discovery and utilization clinically.

本课题采用CE-MS深入分析“青蒿-鳖甲”药对配伍前后的化学图谱特征；将“青蒿-鳖甲”药对及其中的代表性成分（青蒿素衍生物等）作用于裸鼠移植瘤的动物实验和基因沉默构建质粒转染的细胞中探讨HIF1α-miR-124-P4HA1信号通路中HIF1α、miR-124、P4HA1 的基因和蛋白表达水平，检测细胞和肿瘤组织中MMP1和FLRT3的蛋白水平。同时采用CE-MS完成各组药物处理后的细胞胞内外代谢产物和裸鼠的血、尿、瘤组织的代谢组学分析；最后通过生物素标记技术完成青蒿素衍生物在该信号通路中的跟踪。通过动物、细胞、分子“三个水平”探讨这一新颖的信号通路中羟脯氨酸与“青蒿-鳖甲”药对以及青蒿素衍生物等代表性成分之间的相关性，进而阐明羟脯氨酸在“青蒿-鳖甲”药对抑制肝癌中的关键作用，为深化对疗效确切的传统中医药方剂的科学认知提供科学依据，为新的分子靶点的发现以及广泛的临床应用提供可能。

本课题采用色谱-质谱联用技术深入分析了“青蒿-鳖甲”药对配伍前后的化学图谱特征，明确了“青蒿-鳖甲”药对中的主要成分是青蒿素、青蒿乙素、蔓荆子黄素、东莨菪内酯、青蒿琥酯和双氢青蒿素，同时还鉴定了青蒿鳖甲汤中主要的71种化学成分。然后“青蒿-鳖甲”药对（2：5）高剂量能够显著抑制小鼠移植瘤的发生发展，在48h和72h时125 ng/ml “青蒿-鳖甲”（2:5）药对提取物对SMMC-7721细胞活性明显低于24h，并且200 ng/ml的药物浓度作用最为显著。接着我们使用青蒿琥酯联用索拉非尼进行作用机制研究，结果表明：随着青蒿琥酯浓度的升高（0-25μM），青蒿琥酯导致Huh7和HepG2细胞均发生G2/M期阻滞，从而抑制肝癌细胞的生长。青蒿琥酯在12.5μM时p-AKT显著性下调，青蒿琥酯在25μM时p-S6和c-Myc蛋白显著低于对照组中的水平。这些结果表明经典的mTOR信号传导途径的激活被抑制。使用不同浓度的索拉非尼（0-5μM）与12.5μM的青蒿琥酯联用处理细胞48h之后，与索拉非尼单独处理相比较，两药联合使用细胞的活性被更加显著性抑制，呈现出一定的浓度依赖性，两药联合使用后 p-AKT和c-Myc的表达量显著降低。最后使用气相色谱-质谱联用分析青蒿琥酯治疗肝癌的机理，结果表明：对照组与青蒿琥酯组相比，从两种肝癌细胞中共同检测到40 个差异代谢物，17个差异代谢物显著上调，如鸟氨酸、山梨醇、腐胺等， 23个差异代谢物显著下调，如：甘氨酸、谷胱甘肽、天冬氨酸、谷氨酰胺等，涉及到46条代谢通路的改变，其中主要涉及到丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，氨基酰-tRNA的生物合成，氮代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，谷胱甘肽代谢5条代谢通路。最终本课题通过动物、细胞、分子“三个水平”探讨了“青蒿-鳖甲”药对以及青蒿琥酯在肝癌发生发展过程中的抑制作用，为深化对疗效确切的传统中医药方剂的科学认知提供科学依据，为新的分子靶点的发现以及广泛的临床应用提供可能。