锌指核酸酶技术制备基因打靶猪的研究

哺乳动物基因打靶技术是研究基因功能，制作基因修饰动物的重要技术手段。在大型家畜动物中，由于未能建立ES细胞，基因打靶只能通过体细胞克隆技术实现。但体细胞增殖能力有限，同源重组率低，使得制作基因打靶大动物的效率极低。新近发展起来的锌指核酶基因打靶技术可以实现对特定DNA位点的识别和切割，使外源基因更容易定点插入，从而可以大幅度提高基因打靶的效率；但目前，上述技术路线在大型哺乳动物中还没有被打通。申请者在已获得多种转基因克隆动物的基础上，选择易于筛选鉴定的HPRT基因为靶基因，采用锌指核酸酶基因打靶技术制作HPRT基因打靶猪，优化其中涉及到的各个关键技术环节，建立一套适合于大型哺乳动物的高效基因打靶的技术路线。该目标的实现，不仅为在猪这样的重要模式动物中研究基因功能打通技术障碍，也将为建立各种具有重要经济价值和医学应用价值的基因定点修饰猪奠定基础。

哺乳动物基因打靶技术是研究基因功能，制作基因修饰动物的重要技术手段。在大型家畜动物中，由于未能建立ES 细胞，基因打靶只能通过体细胞克隆技术实现。但体细胞增殖能力有限，同源重组率低，使得制作基因打靶大动物的效率极低。新近发展起来的锌指核酶基因打靶技术可以实现对特定DNA 位点的识别和切割，使外源基因更容易定点插入，从而可以大幅度提高基因打靶的效率；但目前，上述技术路线在大型哺乳动物中还没有被打通。在本课题研究中，我们将锌指核酸酶打靶技术应用于猪的基因组修饰，并对其中涉及到的各个关键技术环节进行了优化。首先选取PPARγ基因作为靶基因，设计了3对锌指核酸酶，在探索过程中建立了孤雌胚胎锌指核酸酶mRNA注射法用来鉴定锌指核酸酶体内活性，经鉴定这3对锌指有一对具有靶向切割能力。以该锌指核酸酶转染猪胎儿成纤维细胞，经过富集筛选，共计从244个细胞克隆中鉴定出7个阳性细胞克隆，基因打靶效率为2.8%，相比于正常同源重组低于10-6的打靶效率，锌指对体细胞基因打靶效率有着本质的提高。将打靶阳性细胞进行核移植后共获得2头单拷贝PPARγ基因敲除的克隆猪，这是首次成功运用锌指核酸酶对猪内源基因进行打靶，为猪的基因打靶打通了一条高效的技术路线。在完成该课题预期任务目标的同时，我们对近几年新发展起来的更为高效的打靶技术TALEN、Cas9在猪基因打靶上的应用进行了探索，将打靶效率进一步提高，猪成纤维上打靶效率提高到30%以上，双敲效率达7%，并成功获得了RAG1/2敲除免疫缺陷猪模型。该课题研究成果建立了一套适合于大型哺乳动物的高效基因打靶的技术路线，为在猪等重要大型模式动物中研究基因功能打通技术障碍，也为建立各种具有重要经济价值和医学应用价值的基因定点修饰猪奠定基础。