甾体化合物中新型微生物甲氧基化反应机理研究

甾体药物是仅次于抗生素的第二大类药物，甾体激素因对人体各种内分泌具有重要的调节功能和对其相关疾病具有良好的治疗效果，被誉为"生命的钥匙"。甾体药物生产中生物转化技术虽已普遍应用，但因新型生物转化反应与技术进展有限，目前仍以化学合成为主。申请人对"甾体化合物的生物转化与降解"进行了多年研究，发现了一条新的代谢途径，9种新的化合物，两个全新的微生物反应和一个具有高效降解多种甾体化合物的维吉尼亚链霉菌IBL14。本课题拟以微生物IBL14中发现的新型甲氧基化反应为研究对象，应用生物信息学、分子生物学、发酵与生物分离、酶学及分析化学等手段，利用PCR、RT-PCR、2D凝胶电泳、HPLC、IR、MS及NMR等技术，克隆并表达该甲氧基酶，研究其催化反应和作用机理，纯化该酶和研究其酶学性质。为进一步在分子生物学水平上阐明该代谢途径提供依据。同时，该项目也可能为生物转化合成新型甾体药物中间体开辟新途径。

研究初步表明：该酶可能非双组分体系，而属于双酶体系，即代谢物先被羟化酶羟基化，然后O-甲基转移酶将甲基转移到该羟化产物的羟基上。因此作出调整如下，分P450基因鉴定及O-甲基转移酶基因鉴定二个部分分别研究，现已取得如下成果：1）已撰写P450基因功能鉴定的研究论文1篇 [Identification and functional analysis of cytochrome P450 complement in Streptomyces virginiae IBL14，BMC Genomics, 已接受，JCR一区]；2）已完成适用于酶表达与功能鉴定的发明专利2个 [（20120814）一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法，申请专利号201210287000.5; （2)（20120814）一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，申请专利号201210286769.5] 及论文1篇 [Construction of leaky strains with Escherichia coli as a host and extracellular production of exogenous proteins in the strains，已投稿）； 3）相关学术英文专著2部 [（1）(2013) Handbook of Natural Products (Volume 3-Terpenes, Chapter II-Biotransformation of terpenoids/steroids), Springer Verlag, Heidelberg, Germany (In print， 978-3-642-22143-9);（2）（2012）Integrated Biotechnology: fundamentals and applications, Studium Press LLC, Houston, TX 77072, USA, ISBN: 1-933699-70-1] ; 4）另有1篇关于O-甲基转移酶的研究论文和1篇P450基因功能鉴定的研究论文正在撰写中。