HCV感染细胞内特异性内源性干扰素诱导及病毒清除体系的建立

HCV感染是引起人类慢性肝病的主要原因之一。体内及体外实验证实，HCV可在多数感染者中造成持续性感染的主要原因是由于病毒本身对于宿主的先天免疫应答，干扰素诱导的病毒防御机制具有抵抗作用，本申请课题选取在感染细胞内对于内源性干扰素产生起决定性作用的干扰素调节因子（IRF）7的活性片段，利用HCV NS3/4A 蛋白酶可直接切割干扰素信号传导通路中IPS-1的原理，构建仅在HCV感染细胞内特异性IRF表达体系，即在IRF活性片段的C端附加NS3/4A蛋白酶对于IPS-1特异性识别序列及保持稳定性的ER序列，这样IRF进入细胞后，仅在NS3/4A表达细胞内经切割作用，才能发生核转移及对干扰素启动子的激活作用，最终达到诱导内源性干扰素产生，清除病毒的目的。目前本课题组已成功构建了上述表达体系并初步探讨了其在感染细胞内对于干扰素启动子的激活作用。我们相信该体系的建立为开发新型基因治疗药物奠定了基础。

背景：丙型肝炎病毒感染易慢性化且慢性感染往往导致肝硬化和肝癌。虽然聚乙二醇干扰素α和利巴韦林联合抗病毒治疗可使一部分患者获得持续病毒学应答，但仍有近一半的患者对治疗无应答。对宿主的免疫逃避是造成HCV持续感染的原因之一。为了能够从感染的肝细胞内清除病毒而又不造成过强的全身免疫反应，我们构建了一种可在HCV感染细胞内特异性激活干扰素启动子从而发挥其抗病毒活性的结构cMR3。方法：cMR3由干扰素调节因子7（IRF7）具有一个主导活性功能的N-末端、可被HCV NS3/4A蛋白酶特异性切割序列及ER anchor组成。在细胞内有HCV复制时它可以选择性地发挥其活性。我们在此结构中引入了人IPS-1 C-末端氨基酸序列，一方面其作为衔接分子参与RIG样受体信号转导通路，另一方面，研究证实，HCV NS3/4A蛋白酶可有效切割IPS- 1的跨膜区的线粒体外膜的上游位置，并阻止IFN信号传导。此外，为了避免治疗性分子在线粒体中的表达所诱导的线粒体功能障碍和细胞死亡，我们将IPS- 1C-末端5个残基中的3个精氨酸残基替代为甘氨酸残基，使其可定位于内质网膜。研究表明，丙型肝炎病毒复制是定位于ER膜，因此亚细胞定位可保证有效的切割反应。cMR3在HCV感染细胞内具有潜在的对IFN的诱导活性。由HCV蛋白酶切割后，经处理的cMR3可迁移到细胞核中，并激活包括IFN-α6，IFNβ和IFN ISRE在内的各种IFN启动子,从而发挥其抑制病毒复制的作用。此外，我们成功构建表达cMR3重组杆状病毒，利用杆状病毒作为基因治疗的有效载体，开发潜在性的基因治疗药物。结果：在表达cMR3的HCV复制子细胞和JFH1病毒感染细胞内IFN启动子被特异性激活。在cMR3表达的 HCV复制子细胞内病毒蛋白的表达和病毒RNA的复制均被抑制。此外，该重组杆状病毒可使cMR3在目的细胞内有效表达，进而发挥对IFN启动子的特异性激活作用和对病毒复制的抑制作用。结论：这些结果表明，cMR3可选择性在HCV感染的肝细胞内表达I型干扰素，在不造成过度肝损伤的同时可有效清除病毒，并且cMR3杆状病毒表达载体也有望成为潜在的基因治疗工具。