肝细胞癌转移相关蛋白的功能研究

肝细胞癌的转移是影响治疗效果和预后的最大障碍，但其转移的分子机制仍不明确，尚无可用于肝细胞癌转移复发临床检测的生物标志物和有效的治疗靶标。本研究在前期大规模构建与肝细胞转移相关的差异蛋白质谱基础上，系统筛选出可能与肝细胞癌转移相关的候选蛋白，以具备较高转移能力、表达较高水平候选蛋白的HCC97H细胞株为研究对象，采用RNA干涉技术沉默其表达，获得基因沉默的稳定细胞株，而后在体外观察基因沉默后对肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移的影响，以及对荷瘤裸鼠模型生存期和肿瘤转移情况的影响，以此来鉴定候选蛋白与肝细胞癌转移的相关性；并在此基础上研究候选蛋白参与肝细胞癌转移的分子机制，由此进一步探讨肝细胞癌转移的机理。在肝细胞癌发病率日益增高的现状下，本研究为为进一步阐明HCC转移的分子机制提供依据，为临床的诊断和治疗奠定基础，并有可能成为具有原创性的治疗靶标。

前期研究发现Rab27B分子在高转移细胞株表达上调，因此可作为潜在的HCC转移关键蛋白进行深层次的功能验证。HCC的转移过程中涉及到细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭等方面的性质，因此本研究也从这几个方面进行。首先，在体外通过实验比较shRab27B、mock和HCC97H细胞株的增殖、黏附、迁移和侵袭能力，结果显示稳定敲低Rab27B的HCC97H细胞株shRab27B细胞与mock及HCC97H细胞相比，其体外贴壁增殖、黏附、迁移和侵袭能力均显著下降，这说明Rab27B表达量的降低抑制细胞的转移过程，也即体外实验证明Rab27B与HCC的转移过程相关。随后，进一步通过体内实验即裸鼠荷瘤转移模型进行验证，通过向裸鼠脾脏接种shRab27B和mock细胞，观察肿瘤的肝脏转移及肺脏转移情况，接种细胞8周后mock组肝脏肿瘤转移灶质量要显著大于shRab27B组，且接种shRab27B组肝脏转移灶出现的时间要显著晚于mock组的出现时间，这表明Rab27B表达的降低抑制了HCC97H细胞的裸鼠体内的转移和侵袭能力。通过体内外实验确定Rab27B与HCC的转移相关。在确定Rab27B与HCC转移相关的基础上，进一步探讨其参与HCC转移的机制，即其是如何调控HCC转移过程的。Rab27B主要参与调控细胞的囊泡运输过程，在细胞内囊泡定位运输至胞膜的过程中发挥了重要作用，因此，我们推断Rab27B表达量的降低抑制了HCC97H细胞的囊泡分泌过程，从而降低了参与HCC转移的重要分子的分泌量。经过实验验证，可知在胞外分泌蛋白中，shRab27B细胞分泌的尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）和肝细胞生长因子（HGF）的量与mock和HCC97H细胞相比显著下降，uPA和HGF及其受体在肿瘤的转移过程中发挥了重要的作用。因此，我们确定HCC97H细胞中Rab27B表达量的降低抑制了uPA和HGF的分泌过程，从而抑制了HCC97H细胞的转移过程。随后收集不同时期HCC病人临床血清，通过ELISA实验测定Rab27B的表达量，在已发生转移的HCC病人血清中Rab27B的含量要显著高于未发生转移的，因此Rab27B可作为诊断HCC转移的潜在标志物用于临床诊断。