Symplekin蛋白在小鼠精子发生过程中的功能研究

We have constructed a series of proteome profiles describing spermatogenesis and this large-scale identification of proteins provides a rich resource for elucidating the mechanisms underlying male fertility and infertility. Here we focused on Symplekin to explore detailed function. In somatic cells, sympk regulates the interaction of CPSF and CstF as a scaffold protein in the classical pathway of polyadenylation. However in the spermatogenesis, spermatogenic cell usually use non-classical but specific polyadenylation pathway. So during spermatogenesis, we still do not know whether sympk participates in the specific polyadenylation pathway of spermatogenic cells. This study will explore the function of Sympk during polyadenylation of spermatogenesis through the conditional Sympk knock out mice model and try to clarify the protein complex associated with sympk.

在本实验室的前期工作中，我们构建了一系列与精子发生相关的蛋白表达谱系，并筛选到了一批蛋白质，本研究选择Symplekin蛋白开展深入的功能研究。在体细胞的经典多聚腺苷酸化通路中，Sympk蛋白作为一个脚手架协调CPSF和CstF的相互作用，而生精细胞基则通常是利用非经典但特异的多聚腺苷酸化信号通路，因此在其高表达的精子发生过程中，Sympk蛋白是否参与生精细胞特异的多聚腺苷酸化通路，是否依然作为脚手架协调相关蛋白的相互作用还尚未阐明及验证。本研究将通过制备Sympk生精细胞特异性条件敲除小鼠模型深入分析其在精子发生特定多聚腺苷酸化通路中的作用，并试图能够阐明参与此通路的Sympk相关的蛋白复合体。

生精细胞基因表达的一个重要特征就是通过选择性多聚腺苷酸化产生细胞特异性的mRNAs，而且通常是利用非经典的AAUAAA非依赖性的多聚腺苷酸化信号通路。研究表明，生精细胞似乎比体细胞更青睐选择多聚腺苷酸化，而且大量的生精细胞转录本与体细胞转录本相比具有较短的3’UTR，这说明了在生精细胞中优先利用了更多的近端多聚腺苷酸化位点。.在前期实验室蛋白质组学工作中，在四倍体生精细胞谱系中，我们鉴定到了Sympk基因。文献报道在体细胞的经典多聚腺苷酸化通路中，SYMPK蛋白作为一个脚手架蛋白协调CPSF和CstF的相互作用，但在精子发生过程中，其是否参与生精细胞特异的多聚腺苷酸化通路，以及由此非经典的多聚腺苷酸化通路与体细胞的通路究竟存在哪些差异，是否还有其特异的相互作用的蛋白存在，这些问题都促使我们深入研究Sympk在小鼠精子发生过程中的功能。.本研究首先对该基因在小鼠体内不同时期的表达情况进行了定量（Real time PCR）和定位研究（免疫组化和荧光），同时引进了具有两个loxP位点的类似于Sympk基因全敲的杂合子小鼠，在该小鼠保种和繁殖的过程中，我们发现敲除鼠生出的子代小鼠没有纯合子的存在，这不符合孟德尔遗传定理，因此我们猜测小鼠在胚胎时期纯合子致死。进一步我们将此杂合子小鼠与生精细胞特定DDX4-Cre小鼠进行交配构建了生精细胞特异性敲除小鼠（CKO）。在成年小鼠中我们确认了其雄性不育的表型，但在刚出生的CKO小鼠中，我们却能见到精原细胞。随后我们进一步分析表型出现的时间，2周的小鼠睾丸生精小管内已经出现了大量空泡化，而1周小鼠睾丸生精小管虽然没有明显改变，但是精原细胞数量已经开始有所下降，因此，我们将表型发生的时间点和过程初步确定在1w左右的小鼠精原细胞增值和分化可能出现问题。目前我们已经成功建立了正常小鼠精原干细胞SSCs体外培养的平台，同时留取1w的睾丸组织作为标本作RNA芯片数据的分析。我们希望在芯片中可以鉴定出与Sympk基因表达下调导致的相关基因的显著改变，并试图与多聚腺苷酸化机制进行联系，阐明Sympk基因在精子发生特定多聚腺苷酸化中的作用。