CASK在2型糖尿病胰岛β细胞胰岛素囊泡转运及分泌障碍中的作用及其机制研究

Pancreatic beta-cells dysfunction is one of the major causes of type 2 diabetes. Meanwhile, Insulin granules trafficking and secretion defect plays an important role in pancreatic beta-cells dysfunction..Based on our research thus far, we found that interference CASK expression in primary and islet β cell lines could significantly reduce the insulin secretion in an environment of high K + concentration（KSIS）, which is closely associated with the reduced number of insulin granules anchored on the cell membrane; meanwhile, in the high-fat state, expression of CASK and the function of KSIS is significantly decreased, and the overexpression of CASK can partially reverse insulin secretion disorder caused by fatty acid. One caveat of the research is that the calcium / calmodulin-dependent serine protein kinase CASK is closely associated with insulin granules trafficking and secretion, but the exact mechanism is unclear. .Purpose of the study: through studying the function of islet β cells using multiple methods and constructing transgenic and knockout mice, we propose to ①discuss and verify the mechanism of CASK regulation function of insulin granules trafficking and secretion; ②investigate the effect of upstream regulatory mechanisms on CASK expression (eg: FoxO1). This study could provide new experimental evidence, as wells as a new theory for elucidating the mechanism of islet β-cell dysfunction in type 2 diabetes. It would also offer new potential drug targets for the prevention and treatment of diabetes.

胰岛β细胞功能障碍是2型糖尿病发生发展的核心因素，而胰岛素囊泡的转运和分泌障碍是胰岛β细胞功能损伤的重要环节。.我们前期研究发现：在原代胰岛及β细胞系中干扰钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(CASK)表达可以显著降低高钾刺激的β细胞胰岛素释放(KSIS)，并与胰岛素囊泡在细胞膜上的锚定数减少有关；在高脂作用下，β细胞系中CASK表达显著下降、KSIS功能也显著降低，过表达CASK则可以部分逆转脂肪酸诱导的胰岛素分泌障碍，提示：CASK可能与胰岛素囊泡转运和分泌密切相关，但具体机制尚待研究。.本研究拟：借助胰岛β细胞功能研究的各种方法，并通过构建转基因和基因敲除小鼠的手段，①进一步验证CASK参与胰岛素囊泡转运和分泌的作用及其调控机制；② 探讨影响CASK表达的上游调控机制（如：FoxO1转录因子等）。本研究将为阐明2型糖尿病胰岛β细胞功能障碍的机制提出新理论并为糖尿病治疗靶点提供新思路。

本研究从分子层面探讨CASK在胰岛素分泌过程中功能及作用机制，并且进一步探究了CASK上游的转录因子。同时构建动物模型探讨CASK在胰岛素分泌中的作用。首先通过构建 pEGFP-N2-Cask重组质粒，发现CASK过表达可以有效改善高糖刺激和IL-β导致的胰岛功能受损，增加胰岛素分泌。HIFI-α的激动剂和抑制剂分别可以下调和上调CASK的表达，甲基化转移酶抑制剂5-Aza-dC可以部分升高CASK的表达，说明高糖毒性可能通过介导HIF1α导致CASK的表达下调，而CASK表达减少可以参与IL-β引起的胰岛素分泌功能障碍，其原理可能部分由于DNA甲基转移酶升高了Cask基因的甲基化水平。通过合成PPAR-γ的siRNA发现敲除PPAR-γ可减少CASK的表达，运用ChIP和荧光素酶实验提示PPAR-γ可以和Cask的启动子结合，从而得知Cask为PPAR-γ的下游之的靶基因一。通过免疫共沉淀联合质谱技术，筛选出在高钾刺激下胰岛素分泌过程中100余个可能与CASK相互作用的蛋白。结合生物信息学分析最终筛选出3个与cask相互作用的蛋白（ MInt1，Munc18-1，Nephrin ）。研究进一步构建了研究建立了胰岛β细胞组织特异性Cask基因敲除鼠，发现CASK可以调控胰岛素分泌，敲除CASK基因抑制了β细胞分泌胰岛素，影响小鼠糖耐量水平。项目资助发表核心论文5篇，待发表两篇 。培养硕士生3名，博士3名。项目投入经费58.0000万元，累计支出44.6140万元，剩余13.3860万元，剩余经费计划用于本项目研究后续支出。