转染siRNA-VEGF-C的淋巴管内皮祖细胞靶向抑制肺癌淋巴管生成的实验研究

抗淋巴管生成是肿瘤生物学治疗新的策略。血管内皮生长因子（VEGF）-C是特异性淋巴管内皮细胞生长因子，能促进肺癌淋巴管生成和淋巴道转移。本课题以体外培养扩增的淋巴管内皮祖细胞（LEPCs）为细胞载体，构建针对VEGF-C的RNA小分子干扰(siRNA)序列，通过腺病毒转染siRNA-VEGF-C进入LEPCs，再静脉注射入肺癌动物模型内，利用内皮祖细胞的天然肿瘤组织趋化性，观察转染siRNA-VEGF-C的外源性自体LEPCs对肺癌组织淋巴管生成的靶向抑制效应，以及其对肿瘤生长、淋巴结转移的影响，并从其对淋巴细胞趋化因子及其受体表达的影响角度探讨其抑制淋巴管生成的可能机制，为肺癌的抗淋巴管生成治疗提供实验依据。

本研究通过检测NSCLC肺癌组织中VEGF-C和VEGFR-3表达，分析这两种蛋白与肿瘤LMVD、淋巴结转移情况、临床复发和术后生存期的关系，结果发现，非小细胞肺癌组织中VEGF-C的高表达与癌旁组织淋巴管的高表达有密切关系，VEGFR-3的阳性脉管数与肺癌淋巴结转移相关联，可作为肺癌诱导生成淋巴管研究的量化指标。在体外细胞实验中，我们确立了一套自通过分离小鼠骨髓单核细胞进行EPC诱导培养的培养方法，并通过细胞形态学观察、细胞表面抗原测定及细胞功能检测三方面确定我们所培养的细胞为EPC，为本项研究中后续部分中细胞移植实验奠定了基础。在本实验中我们首先合成了3对针对VEGF-C mRNA序列的siRNA, 并进行同源性检测，避免对其它基因的干扰。在确认最佳转染条件后，我们将siRNA以lipo 2000转染EPC，使用MTT法检测体外培养的EPC的增殖能力，结果提示，三对合成的干扰序列中siRNA-1#的抑制EPC增殖的能力最强。随后，我们利用Fibrinogen胶3D模型体外模拟脉管发生系统，将siRNA转染EPC，结果发现，与对照组相比，转染siRNA-VEGF-C后，体外模拟的淋巴管生长受到明显抑制，单位体积内脉管数量显著少于对照组，提示在体外实验中抑制VEGF-C表达能抑制淋巴管生成。研究采用绿色荧光小鼠获得EPC，尾静脉注射荷瘤小鼠，荧光显微镜下观察绿色荧光表达，发现外源性EPC可特异性归巢于肿瘤组织，主要表达于脉管系统内。在皮下注射肺癌细胞株构建的小鼠肺癌模型性，我们通过尾静脉注射转染体外细胞学实验筛选获得的siRNA-VEGF-C序列的EPC，观察肿瘤大小，采用免疫组化法检测肿瘤组织中淋巴管密度，结果发现，与对照组相比，注射siRNA组瘤体体积明显缩小，淋巴管密度明显降低。以上研究提示，提示外周给予的转染siRNA-VEGF-C的EPC能靶向抑制荷瘤小鼠肿瘤组织的生长，其抑瘤作用于抑制淋巴管生成密切相关。