诱导人脂肪干细胞重编程为淋巴管内皮细胞再生淋巴管的实验研究

Obstructive lymphedema is the tissue edema resulted from the lymphatic vessel defects. The drawbacks of traditional reconstructive lymphatic surgery lie in the insufficency of surgically reconstructed lymphatic vessels. Although the advent of tissue engineering and regenerative medicine potentially provides a new approach for repair and reconstruction of lymphatic vessel defects, the lack of suitable source cells from which to lymphangiogenesis. Cell reprogramming is a major scientific breakthrough in recent years. It is proved that the outlet of the reprogramming may not be return to embryonic state, but the cells can be directly changed to another new differentiated cell. When the extract of donor cells(including cytoplasm and nuclear components) is introduced into receptor cells(adult stem cells or fibroblasts),the receptor cells can express the phenotype of donor cell. The preliminary studies confirmed that the human lymphatic endothelial cells (LEC) extract was introduced into human adipose stem cells(ADSC), allowing the latter to express LEC marker. The experiment will further study the effect of the LEC extract on the ADSC, meanwhile study the feasibility of reprogramming ADSC as seeding cells to repair lymphatic defects. Besides, it will be investigated in this study that the mechanism of reprogramming, including identification of the reprogramming substances.The establishment of method on nuclear and cytoplasm extract reprogramming will help to identify, purified the key substance of extract.The success of this study will provide a new technological means for the cells differentiation and provide new seeding cells for lymphatic tissue engineering and regenerative medicine.

阻塞性淋巴水肿是由于淋巴管缺损导致淋巴回流障碍而引起的组织水肿。传统淋巴管修复和重建手术存在淋巴回流不充分的缺点。再生医学和组织工程为淋巴管缺损修复提供了一个崭新的方向,然而其研究受限于种子细胞的缺乏。细胞重编程是近年来的重大科学突破，目前证实细胞重编程的出路未必一定回归胚胎状态，而是直接赋予细胞新的成熟命运。供体细胞之细胞抽提物（包含细胞质及细胞核的可溶解成分）引入另一种受体细胞（成体干细胞或成纤维细胞）内，可使受体细胞表达供体细胞表型。前期研究证实人淋巴管内皮细胞抽提物引入到人脂肪干细胞中，可使后者重编程而表达淋巴管内皮细胞标志。本课题重点研究淋巴管内皮细胞抽提物对脂肪干细胞的重编程作用，重编程脂肪干细胞向淋巴管内皮细胞分化再生淋巴管的可行性，进一步鉴定抽提物中的关键物质，初步研究重编程机理。本研究的成功为细胞定向诱导分化提供新的技术手段，为淋巴管再生与组织工程研究提供充足细胞来源。

脂肪间充质干细胞（ ADSC）移植正逐渐成为淋巴水肿治疗领域的热点，然而无论在动物实验还是临床实验中都存在着存活率低、分化效率不理想等状况。如何提高存活及分化效率成为我们关切的问题。传统的淋巴内皮细胞分化诱导培养基的组成为 VEGF-A、 VEGF-C、 EGF，其中 VEGF-C 是启动分化的决定性因素，该配方的可行性已经得到了广泛证实。 IL-7 是一种多效的细胞因子，其具有促进分裂增殖、分化的作用，可激活多条信号通路，作用较为广泛。近年来，其在淋巴管新生领域的作用得到越来越多的重视，但是否能够促进 ADSC 向 LEC 并未见文献报道。鉴于此，我们通过向传统的淋巴管内皮诱导培养基中添加 IL-7，观察诱导后淋巴管内皮细胞特异表型表达的变化，来探索 IL-7 对脂肪干细胞向淋巴管内皮细胞分化的影响。我们通过形态分析，Q-PCR，免疫荧光，蛋白质印迹法，流式细胞分析术等多种手段来进行验证。结果显示，我们从临床获取的腹部及大腿部抽脂患者的脂肪中，成功培养出脂肪间充质干细胞，且具有多向分化能力，接着我们从基因及蛋白层面全面分析了淋巴管内皮细胞的特异标记Prox1、 LYVE-1、 Podoplanin 及 VEGFR-3 的变化情况，发现经过IL-7处理的脂肪干细胞淋巴管特异标记的表达量都要高于 未处理组。并利用流式细胞术及免疫荧光双染法进一步确定了分化细胞的特性。同时我们还对分化途径的相关信号通路MAPK/ERK、PI3K/AKT 进行了检测，发现 AKT 通路的磷酸化水平上升，而 ERK 通路则无明显变化。我们的研究提高了脂肪间充质干细胞向淋巴管内皮分化的效率，为利用组织工程的方法构建淋巴管网络提供了支持。