选择性识别端粒蛋白p65的苯并吡喃新先导：优化设计合成及作用机制

Telomerase is a broad spectrum anticancer target which specific express in tumor cells. Because telomerase complex structure, no efficient inhibitors have not been designed. p65 is a major protein of synthesis telomerase, in order to terminate the abnormal function of telomerase activity, this study will design small molecules targeting p65, aims to target assembly process of telomerase, blocking its synthesis. Based on the latest understanding p65 function with structural biology and the basis of the already structure-activity relationships between compounds benzopyran derivatives and inhibition activity of tumor cell proliferation, we will carry out this plan. Furthermore, based on p65 protein crystal structure and key residues, using computer-aided design, in combination with other methods, rational molecular will be designed in this study. Then, a serials novel benzopyran compounds will be directed synthesized, and the compound library with structural diversity will be built. At last, cell proliferation of molecular levels and telomerase inhibition activity is to screened. Based on structural optimization OF 3D-QSAR, the initial active site recognition will been screened by Co-IP and residues mutated experiments, followed by incubation with highly active compounds eutectic p65 complexes, parsing the fine structure of the active site; Western blotting discuss its preliminary mechanism. I hope the novel lead compound with high selectivity targeted assembly process of telomerase will be found.

端粒酶在癌细胞中特异性高表达，是一种广谱的抗癌靶标。但由于端粒酶结构复杂，一直没有筛选出高效抑制剂。p65是合成端粒酶的主要蛋白。为了拓展靶标端粒酶的研究新思路，本申请基于调控端粒酶的合成过程，拟设计小分子靶向p65，从而靶标端粒酶的装配过程，阻断其合成，抑制癌细胞过度增殖。借助结构生物学对p65的最新认识，本申请在前期苯并吡喃抑制癌细胞增殖初步构效关系的基础上，依据p65蛋白晶体结构和关键残基, 利用计算机辅助设计，结合其它方法，开展基于靶标与机制的分子设计。定向合成新型苯并吡喃及五环三萜化合物库，然后进行细胞增殖及分子水平蛋白活性筛选。构建高效的三维定量构效关系，开展先导定向优化，最终筛选出高选择性靶标端粒酶装配过程的新先导。Co-IP与残基突变实验对靶标选择性及活性位点进行确认。培养先导化合物与p65复合物共晶，解析复合物精细结构；Western blotting探讨其初步作用机制。

端粒酶在多数癌细胞中有不同程度的高表达，异常活跃的端粒酶会导致癌细胞无限增殖。p65是合成端粒酶主要蛋白，本课题设计小分子靶向p65，通过靶标端粒酶的装配过程，阻断其合成与过表达，最终抑制癌细胞的过度增殖。为了筛选抑制癌细胞过度增殖的高端粒酶活性小分子，本课题在分析p65三维结构及前期总结的初步构效关系的基础上，开展了大量的新型化合物的设计合成与端粒酶活性筛选，2016-2019年共设计、合成了592个新型化合物，进行了深入的构效关系分析与总结。所有化合物均通过1H NMR, 13C NMR等表征确证。分述如下：.一) 设计合成了100个新型2H吡唑类衍生物及A4-司他夫定类似物，筛选出3~5个具有较高细胞及端粒酶活性的新结构。建立了小鼠S180肉瘤型、EAC腹水型和Heps肝癌移型、DEN诱导的大鼠肝肿瘤模型。设计合成的A4-司他夫定类似物可以提高大鼠的体重，降低肝癌大鼠死亡率，明显降低肝癌大鼠肝脏结节数、肝重、肝指数，显降低肝癌大鼠血清中升高的AST、AST及APF的含量，改善肝癌大鼠肝脏病理损伤程度。.二) 在分析p65三维结构及上述初步构效关系的基础上，设计合成了80多个紫草素衍生物，找到2-3个活性结构。.三) 设计合成了50个新型杨梅苷衍生物及82个乙烯磺酰氟化物。筛选出1个高活性结构，研究表明该化合物能够调控端粒酶结合蛋白Dyskerin。蛋白免疫印迹实验证明其阻滞凋亡和周期相关蛋白，初步揭示其诱导肿瘤细胞凋亡的通路机制。TRAP-ELISA结果证实了小分子化合物对肿瘤细胞端粒酶活性的抑制作用。.四) 在上述研究积累的基础上，优化设计合成了A和B两个系列，一共66个含有酰胺和1, 3, 4-噁二唑部分的2-苯基-4H-色烯-4-酮衍生物作为潜在的端粒酶抑制剂。另外，基于BIBR1532的结构特点及其与靶标可能的结合模式、国内外已报道的小分子端粒酶抑制剂的结构特征及药物分子设计的策略，导向性设计合成了三大类具有不同结构特点的目标物和其他具有结构相关性丙烯酰胺类衍生物，共得到76个目标化合物。蛋白免疫印迹结果表明目标物通过降低Dyskerin-NOP10-NHP2三聚体蛋白的表达来抑制端粒酶活性。