miRNA在调控胃肠平滑肌细胞合成SCF过程中作用的研究

新近研究发现：肠梗阻引起扩张段肠管平滑肌SCF蛋白及mRNA含量降低，这种病理生理变化发生较早，出现在Cajal细胞（ICCs）数量减少和形态异常之前，但其发生机制不明，推测与SCF mRNA的翻译抑制或稳定性降低有关。已知miRNA具有基因转录后的负性调节作用，抑制多种蛋白的表达。为此，本项目拟利用组织培养和不完全肠梗阻小鼠模型，从寻找持续性肠扩张导致管壁平滑肌SCF表达下降的miRNA入手，预测并验证调控SCF表达的miRNA：①通过软件预测调控SCF表达的miRNA；②检测扩张肠管平滑肌miRNA的量与SCF表达的关系；③构建带有miRNA作用位点的荧光素酶表达载体，通过共转染实验，鉴定调控SCF表达的miRNA；④上调和下调miRNA表达，检测对SCF表达的影响。期望能够初步阐明持续性肠扩张引起平滑肌SCF下降的分子机制，为临床预防和治疗胃肠运动功能障碍性疾病提供新思路。

胃肠动力学研究是近年备受临床医学研究者关注的热点问题之一。其中，Cajal间质细胞（ICCs）作为胃肠自主节律性运动的起搏细胞（pacemaker cells）发挥重要调控作用；临床病理研究表明：ICCs减少和细胞网络稀疏等病理改变与许多临床常见的胃肠运动功能障碍性疾病密切相关。新近研究发现：肠梗阻引起扩张段肠管平滑肌SCF蛋白及mRNA含量降低等病理生理变化，出现在Cajal细胞数量减少和形态异常之前，但其发生机制尚不清楚，推测与SCF mRNA的翻译抑制或稳定性降低有关。已知miRNA具有基因转录后的负性调节作用，抑制多种蛋白的表达。为此，本项目主要是：①利用慢性肠管扩张小鼠动物模型，寻找调控平滑肌细胞表达SCF的候补miRNA；②通过软件预测调控SCF表达的miRNA；进而研究这些miRNA与胃肠运动功能障碍性疾病中ICCs结构和功能等病理变化的关系，③构建带有miRNA作用位点的荧光素酶表达载体，通过共转染实验，鉴定调控SCF表达的miRNA；④上调和下调miRNA表达，检测对SCF表达的影响。期望能够初步阐明部分胃肠运动功能障碍性疾病所致的SCF减少，进而引起ICCs的分子机制。研究PDGF /PDGFR以及HCN在成年动物胃肠道的分布与可能功能进行了较详细研究。.主要结果如下：慢性肠管扩张可使肠壁ICCs数目减少，在梗阻部位近端尤为明显，而且，残存ICCs的突起变 粗，分支减少，细胞网络稀疏。小肠的自发节律性收缩明显减弱、收缩幅度减少，提示ICCs的减少与胃肠自主节律性运动功能下降有关。而且，实验还发现：慢性肠管扩张可使肠壁平滑肌SCF表达下降、经Real-time PCR检测发现：扩张肠管平滑肌表达miR-34c较假手术组小鼠明显上调42倍；目前已建立胃肠平滑肌细胞体外培养，并构建荧光素酶报告系统质粒，进行miR-34c调控SCF mRNA翻译的实验研究，期望达到预期实验目的。另外，本研究对PDGF及其受体PDGFR 在胃肠的分布进行了研究，证明受体PDGFR阳性细胞存在于整个胃肠道；双标免疫染色结果表明PDGFR阳性细胞为成纤维细胞，分布在ICCs和肠神经丛附近。证明了HCN2 阳性细胞为胆碱能神经元，不存在于ICCs，鉴于二者在分布上密切相关，提示HCN可能通过调节胆碱能神经功能参与ICCs自主节律活动调节，影响胃肠自主节律功能。