灵芝三萜酸下游合成路径关键CYP450s基因挖掘与功能分析

Ganoderic acids are important triterpenoids produced in Ganoderma lucidum and show various benefits, including sedative and analgesic, hepatoprotective, and antitumor activities. However, the knowledge on how ganoderic acids are biosynthesized in Ganoderma lucidum is limited, especially its downstream pathway remains elucidated to date. Judging by their molecular structures, cytochrome P450 monooxygenases have been considered as the most important enzymes in the downstream pathways. In this project, through combining the comparative transcriptome and metabolite data of G. lucidum over different development stages, we aim to isolate the gene coding for the key CYP450s, which catalyzes the oxidation of ganoderic acid at C15 position. The function of those CYP450s candidates will be investigated using either a yeast expression system or G. lucidum transformation system. The success of the project will supply necessary genes for the metabolic engineering of ganoderic acids in other organisms and form the basis for understanding the downstream pathways to synthesize ganoderic acids in G. lucidum .

三萜类灵芝酸是药用真菌灵芝的重要活性成分，具有镇静止痛、保肝护肝、抗肿瘤等功效。 然而，灵芝酸的生物合成尤其是其下游合成途径至今仍然未知。从灵芝酸分子结构分析，普遍认为细胞色素P450单加氧酶是该下游途径中最重要的关键酶。本项目拟以不同发育时期的灵芝为研究材料，通过比较代谢组学与转录组学关联分析，重点挖掘催化灵芝酸C15位置氧化反应的P450酶基因；利用酵母表达系统和灵芝原生体质转化系统对其功能进行分析。本项目的成功开展将为异源生物合成灵芝酸提供必要的基因资源，对于解析灵芝酸下游合成通路具有重要的理论意义。

灵芝三萜是灵芝的主要活性成分，而灵芝酸是灵芝三萜类化合物的重要活性成分，是一种具有镇静止痛、保肝护肝、抗癌抑制组织胺释放解毒等多重功效的天然有机化合物。羊毛甾醇转化生成灵芝酸的合成通路为灵芝酸合成下游路径，从灵芝酸的分子结构分析，羊毛甾醇分别在C3、C7、C11、C12以及C15进行一系列的氧化反应，最终形成结构多样的灵芝酸。申请人前期分析了灵芝7个不同发育阶段的不同灵芝酸的含量，发现灵芝酸C2与B、G与C6、A与D几乎存在相同的合成特征。结合不同灵芝酸的分子结构比较分析，推测灵芝酸C2、G和A分别是灵芝酸B、C6和D的合成前体。我们测了3个不同发育时期赤芝样品的RNA，构建转录组，应用生物信息学相关方法对测序所得到的Unigene序列进行分析，并利用荧光实时定量PCR对78个候选CYP450s基因的表达水平进行检测，发现有18个基因与羊毛甾醇的表达趋势一致，进一步用R软件（3.1.2）将NMR代谢物相对定量结果以及转录组测序结果进行相关分析，找出8个与灵芝酸代谢相关的候选CYP450s基因。我们将候选CYP450s基因克隆到酵母表达载体上，转入改造后的WAT11酵母中，分别加入底物灵芝酸C2、G和A和羊毛甾醇，用HPLC和LC-MS/MS检测表达产物，以验证候选CYP450s基因的功能。结果发现，GL31768能以灵芝酸C2为底物在C7、C12以及C15催化氧化反应生成灵芝酸C6，GL21663能以灵芝酸G为底物在C7催化氧化反应生成灵芝酸C6。我们利用不产羊毛甾醇的菌株GiLL77，发现GL22657能以羊毛甾醇为底物催化氧化反应加一个羟基。此外，我们构建了GL21663的RNAi和过表达载体，转入灵芝原生质体，利用荧光定量PCR筛选沉默或过表达效果好的突变株；将突变株培养成灵芝子实体，比较分析基因沉默和过表达突变株和野生型子实体的灵芝酸C6含量的差异，验证了GL21663在灵芝子实体中的功能。这些结果将有助于灵芝酸生物合成途径的阐明以及为异源生物合成灵芝酸打下基础。