灵芝三萜生物合成调控网络中关键基因的克隆及其对茉莉酸甲酯响应机理的研究

灵芝三萜是灵芝的主要药用成分，其含量的多少决定了灵芝药用价值的高低。申请者前期已克隆了灵芝生物合成途径中的多个关键酶基因，发现外源添加茉莉酸甲酯对灵芝三萜生物合成具有明显的诱导作用，本项目是在前期研究的基础上通过cDNA-AFLP的方法，进一步研究茉莉酸甲酯诱导下灵芝转录组的变化，从中克隆灵芝三萜生物合成调控网络中的关键基因。根据不同三萜生物合成水平下，这些基因转录水平的变化，确定1-2个进一步研究的关键基因，克隆基因全长及启动子序列，通过启动子的5′缺失分析，研究这些基因响应茉莉酸甲酯的机制。同时，进一步通过超量表达研究该基因在灵芝三萜生物合成中的功能。研究结果将有助于进一步阐明茉莉酸甲酯诱导灵芝三萜生物合成的网络调控机制，为生产上提高灵芝三萜含量提供理论基础。同时加深人们对萜烯类化合物生物合成生理意义的了解，为更深入研究其它重要萜烯类化合物生物合成提供借鉴。

灵芝三萜是灵芝的主要药用成分，其含量的多少决定了灵芝药用价值的高低。申请者前期克隆了灵芝三萜合成的多个关键酶基因，发现外源茉莉酸甲酯对灵芝三萜生物合成具有明显的诱导作用。本项目在前期研究的基础上通过cDNA-AFLP的方法，采用64对引物组合对茉莉酸甲酯诱导下灵芝转录组进行分析。经统计，64对引物组合一共产生3910个转录片段(TDFs)，其中约有919个TDFs的表达谱发生了变化，上调表达703个，下调表达216个。选择458个TDFs进行回收、TA克隆、测序后，获得390个高质量的TDFs，其中90个TDFs具有已知功能的同源蛋白。通过荧光定量PCR验证了这些基因转录水平的变化，确定了MAPK4、rho、mob、mvd和cyp51等三萜合成相关的关键基因，克隆基因全长及启动子序列，并对其启动子进行分析。同时，通过超量表达技术和基因沉默技术研究了MAPK4、rho、mvd和cyp51等关键基因在灵芝三萜生物合成中的功能。结果表明，mvd和cyp51超量表达转化子以及MAPK4和rho沉默转化子的三萜含量变化显著。研究结果不仅发现了许多参与灵芝三萜调控的新的候选基因，也对茉莉酸甲酯调控灵芝基因表达和次生代谢提供新的理解，为生产上提高灵芝三萜含量提供理论基础。同时加深人们对萜烯类化合物生物合成生理意义的了解，为更深入研究其它重要萜烯类化合物生物合成提供借鉴。