薯蓣皂素合成下游路径关键P450酶基因的分离与功能分析

Diosgenin is a steroid triterpenoid with a strong anti-tumor activity and more than 400 types of steroid drugs in the world are derivatives of diosgenin. The traditional approach to the production of diosgenin has met a serious pollution problem. On the other hand, synthetic biology technique will serve as an alternative way to prepare diosgenin at a large scale with less environmental pollutions. However, the prerequisite for this new technology is the successful isolation of diosgenin biosynthesis genes. To date, the biogenesis of diosgenin in vivo is poorly understood, and especially the genes encoding P450 enzymes involved in its downstream pathway are unknown. In this project, two diosgenin-producing plant species, including Dioscorea zingiberensis and Trigonella foenum-graecum L., will be applied as the research materials. By comparing the transcriptomes of both species, we would focus on the analysis of P450 genes from the data sets. For determining the P450 candidate genes, the relevance of the P450 genes transcript abundance to diosgenin accumulation will be studied using LC-MS and Real-time PCR techniques. After the selection of the P450 candidates, their biochemical functions will be investigated by heterologous expressions in yeast cells and Trigonella foenum-graecum L. hairy roots. The successful lunch of this project will not only form a basis for the elucidation of diosgenin biosynthesis pathway but also provide necessary genes for producing diosgenin via the synthetic biology technique.

甾体三萜物质薯蓣皂素具备较强抗肿瘤功效，更是世界上400多种甾体激素类药物的前体物质。薯蓣皂素传统制备方式因环境污染问题已面临极大困境，近期合成生物学技术的发展为制备薯蓣皂素提供了崭新思路，但该项技术的前提是薯蓣皂素合成基因的挖掘。目前薯蓣皂素下游合成路径至今未被解析，尤其是其中关键P450酶基因仍未被分离。本项目拟以两种药源植物—盾叶薯蓣与葫芦巴为研究材料，采取比较转录组学研究策略，挖掘薯蓣皂素下游合成路径关键P450酶基因；利用LC-MS与荧光定量PCR技术，分析P450酶基因表达与薯蓣皂素合成关联性，确定候选P450酶基因；利用酵母表达系统与葫芦巴植物发根遗传转化体系对候选P450酶基因的功能展开分析。本项目的成功开展在理论上将为解析薯蓣皂素下游合成路径提供数据支撑、在应用层面上将为运用合成生物学技术制备薯蓣皂素提供必要的基因元件。

薯蓣皂素是世界上200多种激素类药物的前体，其本身对于乳腺癌、大肠癌以及肺癌等疾病均具有显著抑制功效；本项目立项初期薯蓣皂素生物合成途径尚未得到完全解析，尤其是其下游途径关键P450酶基因未得到分离，本项目旨在分离薯蓣皂素下游途径P450酶基因，并对它们的功能进行分析，取得了以下研究结果：..1、以两种薯蓣皂素药源植物-葫芦巴与盾叶薯蓣为研究材料，分析了葫芦巴植物响应茉莉酸甲酯诱导以及不同发育时期盾叶薯蓣植物的薯蓣皂素合成情况；..2、分别构建了葫芦巴植物响应茉莉酸甲酯诱导以及盾叶薯蓣植物不同发育时期的比较转录组数据库，原始测序数据均已提交至NCBI公共数据平台，盾叶薯蓣数据库编号为SRR6281649-SRR6281651; 葫芦巴植物转录组数据库编号为SRR8281654-SRR8281660; 结合薯蓣皂素合成与基因表达相关性分析，发现了可能控制薯蓣皂素合成的系列P450酶基因，相关成果在SCI杂志Molecules进行了公开发表(Zhou et al., Molecules, 2019, 24: 140; Li et al., Molecules, 2018, 23: 454 )；..3、为便于在植物体内开展基因功能分析工作，构建了葫芦巴植物发根遗传转化体系，有关遗传转化体系构建成果在中文核心期刊进行了公开发表（刘梦迪等，植物科学学报，2019， 37（1）：87-92；李晓华等，植物科学学报，2017，35（5）:735-740）。..4、项目组将上述所有候选P450酶基因依次在酵母表达体系中进行了功能验证，实现了薯蓣皂素合成通路的打通，并发现由于酶的功能演化造成了葫芦巴与盾叶薯蓣两种植物中薯蓣皂素合成酶的差异，相关结果正在整理成文有待2021年度公开发表。