Notch信号通路调控食管Barrett化生的分子机制研究

The underling pathogenesis of Barrett’s esophagus, a precancerous leision caused by long-term gastroesophageal reflux, is still unclear. According to our previous research, Notch signaling plays an important role in the development of esophagal mucosal damage induced by gastroesophageal reflux, and Barrett metaplasia might be regulated by the Notch downstream target gene ATOH1, which could bind to CDX2 promotor and induce its expression. In the current study, in vitro experiments will be conducted to confirm the role of Notch1/Hes1/ATOH1/CDX2 pathway in the pathogenesis of Barrett’s metaplasia induced by gastroesophageal reflux. Chromatin Immunoprecipaitation and Promoter Dual-Luciferase Detection will be used to test if ATOH1 could bind to CDX2 promoter and modulate its expression. Besides, an observational cohort of the patients after esophagectomy and gastroesophageal anastomosis will be used as an ideal gastroesophageal reflux model to prospectively evaluate the role of Notch1/Hes1/ATOH1/CDX2 signaling during the process of Barrett metaplasia in human. Our study will help to clarify the molecular pathogenesis of Barrett esophagus, and benefit the prevention and treatment for the esophageal mucosa damage caused by gastroesophageal reflux.

Barrett食管是一种癌前病变，其分子机制尚不清楚。我们前期研究显示Notch信号通路可能通过其下游靶基因ATOH1与Barrett化生关键基因CDX2直接结合并启动后者表达，从而调控胃食管反流诱导的Barrett化生过程。本研究一方面将利用体外实验验证Notch1/Hes1/ATOH1/CDX2通路在胃食管反流诱导食管Barrett化生中的调控机制。采用染色质免疫共沉淀及荧光素酶报告基因方法明确ATOH1能否与CDX2直接结合并启动其表达，促进Barrett食管化生。另一方面，将创新性地利用目前已启动的纳入食管切除胃食管吻合术后患者的观察队列，作为理想的胃食管反流人体模型，前瞻性验证正常食管鳞状上皮在胃食管反流的作用下向Barrett化生过程中Notch1/Hes1/ATOH1/CDX2的表达变化及作用。为进一步阐明食管Barrett化生的分子机制及反流性食管损伤的防治奠定基础。

本研究旨在探讨Notch信号通路在反流诱导的食管Barrett化生的分子机制。纳入正常食管、返流性食管炎及Barrett食管组织各50例。通过免疫组化法，RT-qPCR检测Notch通路相关基因（Notch1、Hes1、ATOH1和CDX2）的表达。同时，前瞻性纳入食管切除胃食管吻合术后患者作为理想的胃食管返流人体模型，探讨在不同反流程度及不同反流持续时间下，食管上皮细胞中相关Notch信号通路的表达动态表达改变。结果发现在正常食管→返流性食管炎→Barrett食管的返流性损伤序列中，Notch1与Hes1的表达持续降低，而ATOH1与CDX2蛋白/mRNA的表达依次递增。在反流人体模型中我们也发现Notch1-Hes1-ATOH1-CDX2的表达与病理组织损伤、返流持续时间均具有相关性。病理损伤越重、返流时间越长，Notch1和Hes1表达越低，而ATOH1和CDX2表达越高。.在体外细胞试验中，Het-1A细胞在酸性培养基孵育下，形成一个较为完整的可能存在的信息链条：较对照组相比，Het-1A细胞各基因的mRNA或者蛋白表达，Notch1下调→Hes1下调→ATOH1上调→Cdx2上调→MUC2上调/K13下调，且酸度越高，时间越长，趋势越明显。通过沉默Het-1A细胞中的Notch1基因，造成下游基因Hes1和K13低表达，而下游基因ATOH1、Cdx2高表达；通过si-h-RNA-Notch1上调Het-1A细胞中的Notch1基因，则下游各基因出现相反的结果。用染色质免疫共沉淀（ChIP）方法检测ATOH1与Cdx2启动子区域是否能够直接结合，使用启动子报告基因方法验证ATOH1是否可以正向启动Cdx2的表达，结果表明Notch信号通路的下游靶基因ATOH1与Cdx2启动子区域直接结合，并且ATOH1可以正向启动Cdx2的表达。通过沉默Het-1A细胞中ATOH1基因后，其下游基因Cdx2表达降低，柱状上皮相关黏蛋白MUC2表达降低而鳞状角蛋白K13表达升高。.因此，本体内及体外研究提示Notch1-Hes1-ATOH1-Cdx2信号通路在酸刺激下诱导食管鳞状上皮细胞Barrett化生中起到了重要作用。本研究为揭示Barrett化生的具体分子机制，为Barrett的防治，延缓及治疗胃食管反流性食管损伤奠定了基础。