Notch信号通路调控急性中耳炎中黏液细胞化生的机制研究

Otitis media is one of the most common childhood infections, and the most frequent reason children consume antibiotics and cause hearing loss. Mucous cells metaplasia in the middle ear epithelium and mucus secretion increasing are the most significant characteristics of otitis media. In our previous experiment, we successfully established acute otitis media model in mouse by trans-tympanic injection of streptococcus pneumonia. We confirmed mucous cells metaplasia in this model. Upregulated mucous cell-related genes (MUC5AC, AGR2) and downregulated Notch receptors, ligands (Notch1, Notch2, and Dll1), and target genes (Hes1, Hes5 and Hey1) were observed. Especially, the downregulation of Hes1 is profound. But how Notch signaling suppressed related to the mucous cells metaplasia in otitis media is not clear. On the basis of our previous experiment, we hypothesize upregulate the expression of Notch signaling pathway target gene Hes1 can suppress mucous cells metaplasia in mouse acute otitis media. This study by in vivo experiment: through tympanic membrane injection of Hes1 gene recombinant adenovirus vector in mouse streptococcus pneumonia otitis media, using AB/PAS staining, immunofluorescence, real-time PCR, ELISA and so on to observe the suppression of mucous cells metaplasia, mucin expression, and the expression of cytokines, in order to find out ways to restrain mucous cells metaplasia, and to provide theoretical basis for the prevention and treatment of otitis media.

中耳炎在儿童中的发病率高，是儿童使用抗生素及听力下降的常见原因。中耳上皮中黏液细胞化生及黏液分泌增加是中耳炎的显著特征。前期试验中，我们成功建立肺炎链球菌小鼠急性中耳炎模型，并证实中耳黏液细胞化生，黏液细胞相关基因Muc5AC及Arg2上调，Notch信号受体Notch1、Notch2下调，及Notch信号目的基因Hes1、Hes5和Hey1下调，尤其Hes1表达下降，但Notch信号调控黏液细胞化生的机制不明。因此根据前期实验结果，我们提出是否可以上调Notch信号目的基因Hes1来抑制黏液细胞化生。因此本研究通过向肺炎链球菌中耳炎中转染Hes1腺病毒上调Hes1表达，利用黏液细胞AB/PAS染色、免疫荧光、real time-PCR及ELISA等观察对黏液细胞化生的影响、黏蛋白Muc5A等的表达改变及细胞因子表达的变化，旨在找出抑制黏液细胞化生的方法，为中耳炎的预防和治疗提供理论依据。

急性中耳炎中黏膜上皮细胞增殖或分化、黏液细胞增生及纤毛细胞损伤被认为是中耳炎发病的生理病理基础。Notch信号通路是一条影响细胞命运信号转导通路，几乎涉及所有细胞的增殖和分化活动，本试验研究Notch信号通路在中耳炎黏膜上皮细胞中的表达，探讨notch信号通路对中耳炎上皮病理变化的影响。利用体外培养的小鼠中耳黏膜上皮细胞，用notch 信号通路的抑制剂DAPT下调notch 信号通路，利用荧光实时定量PCR检测到黏液细胞标记物Spink4、Tff1、Agr2和黏蛋白Muc2表达均升高；EdU标记的增殖细胞数量减少。基底细胞不均衡的增殖和分化或许是中耳炎疾病发生过程重要的一环，多潜能的基底细胞在炎症刺激下分化为过多的黏液细胞和纤毛细胞，本实验我们利用mT/mG +/+; K5 CreERT2+/-转基因小鼠对中耳鼓室腔基底细胞进行谱系示踪，证实稳态环境下，中耳鼓室腔纤毛细胞可由基底细胞分化而来。而急性炎症状态下基底细胞的分化还需要进一步研究。粘液纤毛清除系统是清除中耳液体和抵抗外界因素的第一道防线。纤毛细胞表面的纤毛摆动使中耳腔液体及异物通过摆动向咽鼓管方向清除，而纤毛摆动与细胞极性有关。平面细胞极性是细胞内部的所有轴丝朝同一方向摆动的基础，从而使纤毛产生协调一致的运动，然而中耳纤毛上皮是否具有成熟的平面细胞极性尚未明确。本实验通过透射电镜技术，在细胞水平面及轴面分别观察成年野生鼠中耳鼓室腔被覆纤毛上皮细胞内基粒的排列。结果表明，鼓室腔被覆纤毛细胞的动纤毛的基粒足部在同一个细胞同一平面指向一致，即具备单细胞极性。同时，相邻细胞内的基粒均朝向一致的方向排列，表明成年小鼠中耳纤毛上皮具备组织平面细胞极性。而炎症状态下此细胞极性和组织平面极性是如何变化还正在研究中。