莱茵衣藻中胆色素介导叶绿体反向信号转导的分子机制

Retrograde plastid signaling plays essential roles in coordination of gene expression between plastid and nuclear genomes and regulation of chloroplast photosynthetic efficiency. We have shown that Chlamydomonas reinhardtii employs the heme catabolic product phycocyanobilin (a special type of bilin) as signaling molecule to detect photosynthetic oxygen evolution, regulate stability of PSI proteins and impact chlorophyll accumulation, but the molecular mechanism remains elusive. In this proposal based on previous work, we plan to express two heterologous proteins: a cyanobacterial phytochrome GAF domain (NpF2164-GAF5) as bilin reporter and an animal biliverdin reductase (rat kidney BVR, EC 1.3.1.24) that can metabolize bilin. Analyses of the purified bilin reporter and phenotypic characterization of BVR transgenic lines will validate whether or not bilin could be exported from chloroplast to cytosol. We next aim to identify the downstream or interacting proteins of bilin biosynthesis and signaling pathway by yeast two hybrid analysis, co-immunoprecipitation/mass spectrometry and suppressor screening. Genetic and biochemical validation of these key factors will shed light on the molecular mechanism of bilin-mediated regulation of photosynthetic gene expression. Last, RNA-seq methodology will be employed to compare the distinction of bilin-regulated nuclear gene network in Arabidopsis and Chlamydomonas. The implementation of this project will not only advance our understanding of the chloroplast-to-nucleus retrograde signaling, it should also be able to provide new insights for genetic improvement of photosynthesis efficiency.

质核反向信息传递对于协调核基因组和叶绿体基因组的表达、调节叶绿体的光合效率起着重要的作用。我们在衣藻中发现血红素的代谢产物胆色素可能作为感受叶绿体光合放氧的信号分子，参与调节光系统I相关蛋白的稳定性并影响叶绿素的积累，但其分子机理不清楚。本项目在该工作基础上，首先在衣藻中表达结合或代谢胆色素的外源蛋白：蓝细菌光敏素和哺乳动物胆绿素还原酶，通过蛋白纯化和转基因衣藻的表型分析来验证胆色素从叶绿体到细胞质的转运；其次，通过酵母双杂交、免疫沉淀质谱联用、抑制子筛选等手段鉴定胆色素信号转导途径中的关键蛋白，再用免疫共沉淀、转基因等技术对互作蛋白进行生化和遗传上的验证，以剖析胆色素调节光合作用相关基因表达的分子机制；最后，通过转录组学方法比较胆色素在衣藻和拟南芥中调控基因表达网络的异同。本项目的实施不仅将丰富对叶绿体-细胞核反向信号转导机制的认识，还将为遗传改造提高光合作用效率提供新途径。

叶绿体中合成的四吡咯分子胆色素作为生色团与光敏素或藻胆蛋白结合，从而实现对光信号的感受或光能的捕捉。然后很多真核微藻既没有光敏素，也没有藻胆蛋白，因此本项目利用莱茵衣藻作为模式生物来揭示胆色素的新型生物学功能。利用胆色素缺陷的突变体hmox1(heme oxygenase 1), 通过光合放氧、光系统活性分析等手段鉴定了胆色素对光系统(PSII, PSI)活性、蛋白复合物形成及光合色素(叶绿素，叶绿醌)的影响，发现PSI及LHCI相关蛋白的积累受到严重抑制。转录组测序表明这些基因在转录水平没有显著变化，因此胆色素在转录后水平调控PSI/LHCI相关蛋白的稳定性；同时，胆色素信号在转录水平调控约50个核基因的表达。通过酵母双杂交筛选互作蛋白，发现四吡咯合成途径关键酶或调控蛋白(LPOR, GUN4)与PCYA1互作；胆色素通过GUN4极大增强了镁离子螯合酶MgCh的体外活性，体内结果表明MgCh的CHLH1蛋白亚基的稳定性也受到胆色素的调控，因此胆色素多角度调控了叶绿素的合成。通过抑制子筛选得到多个可以恢复hmox1光合生长表型的抑制子，发现其中的FdR突变可以有效抑制hmox1的光合缺陷表型。通过在衣藻细胞质中表达可以结合胆色素的外源蛋白DtenPHY1，对该蛋白纯化后的分析表明衣藻中胆色素存在从叶绿体到细胞质的转运；继而通过免疫沉淀-质谱鉴定筛选到DtenPHY1的互作蛋白，包括定位于叶绿体被膜的膜蛋白及细胞质中存在的相关蛋白。同时，我们结合生物信息学分析及对潜在胆色素受体蛋白的生化鉴定，发现多个相关蛋白结合胆色素。对这些胆色素转运蛋白及受体的深入研究将有助于系统阐明胆色素调控光合色素合成、光系统相关蛋白稳定性及衣藻和植物的光适应的分子机制。..