莱茵衣藻膜蛋白Cr-FAX在脂肪酸跨叶绿体膜运输过程中的作用研究

Oleaginous microalgae is one of the most potential way for biodiesel industry. Fatty acid (FA) synthesis occurs in chloroplasts and thus export for subsequent lipid assembly is required. Yet, the mechanism of this transport remains enigmatic. The former research by applicant shows that, a novel membrane protein family FAX may be involved in mediating fatty acid export from plastids (unpublished). Interestingly, in unicellular green algae-Chlamydomonas reinhardtii, the unique ortholog of FAX is exist, named Cr-FAX. And former data imply Cr-FAX is involved in lipid biosynthesis. In this proposal, the phenotype of Cr-FAX mutants are firstly screened. With further lipidomic, subcellular localization and transcriptomic analysis results, Cr-FAX might be argued whether involving in chloroplast fatty acid export. Furthermore, to illuminate the key transporter function of Cr-FAX, Cr-FAX will be transformed into Arabidopsis at-fax knockout mutant and also fat1 yeast mutant, who lost fatty acid transport function. The characterization of Cr-FAX will not only be significant for unknown fatty acid export process in algae, but also represent a powerful tool to increase lipid/biofuel production in green algae.

微藻产油是最具潜力的生物柴油生产途径之一， 研究微藻脂肪酸运输机制对获得高产油微藻具有重要意义。 脂肪酸跨叶绿体膜输出的过程是油脂合成的必需路径，但迄今为止，脂肪酸跨膜输出机制仍有待揭示。申请人此前的研究表明：植物拟南芥（A. thaliana）细胞中，新型的膜蛋白家族FAX与脂肪酸跨膜输出密切相关（尚未发表）。我们在单细胞绿藻-莱茵衣藻(C.reinhardtii)中，发现了和FAX唯一同源的蛋白，命名为Cr-FAX。初步实验表明该蛋白与脂类代谢有关。 本课题以此为出发点，拟通过亚细胞定位、 Cr-FAX突变体的表型、脂类和转录组分析，研究Cr-FAX在脂肪酸跨叶绿体膜运输中的作用。 并在拟南芥FAX1基因敲除突变体At-fax1中及脂肪酸运输缺陷型酵母fat1中进行Cr-FAX的脂肪酸运输功能验证。最终为阐明产油微藻中脂肪酸运输机制提供理论基础，为获得高产油的基因工程藻株提供理论依据。

微藻产油是最具潜力的生物柴油生产途径之一，研究微藻脂肪酸运输机制对获得高产油微藻具有重要意义。项目申请人前期研究表明模式植物拟南芥中的叶绿体膜蛋白AtFAX1 (Fatty Acid Exporter 1)具有将脂肪酸运输到叶绿体外的功能（Li et al., 2015）。然而，对于模式绿藻莱茵衣藻而言，脂肪酸的跨叶绿体膜运输以及对油脂累积的影响尚未有报道。在此背景下，该研究首先通过序列比对分析和基因克隆，获得了莱茵衣藻中的两个FAX（Fatty acid Exporter 1）的同源蛋白，并分别命名为CrFAX1, CrFAX2。随后，我们对FAX同源蛋白序列进行了保守结构域分析，亚细胞定位预测等分析。之后，我们将CrFAX1和CrFAX2分别转化到啤酒酵母细胞中，通过外源添加不同脂肪酸培养酵母菌株的方式，检测酵母细胞内脂肪酸组分的差异变化，发现CrFAX1, CrFAX2均具有运输脂肪酸的功能，而且CrFAX2具有更强的脂肪酸运输能力。通过转基因的方式，分别获得了过量表达CrFAX1和CrFAX2的莱茵衣藻藻株CrFAX1-OX, CrFAX2-OX。这两个衣藻株系的总油脂含量相比野生型都有明显提高，达到250 mg/g，且C18:3, C18:1, C16:0等脂肪酸含量提高最显著。 进一步的缺氮实验表明，转基因工程菌种能够获得450 mg/g的总脂含量，这比野生型高出14%， 而且总不饱和脂肪酸含量的变化最为显著。而当额外分别添加葡萄糖或者醋酸钠作为碳源的情况下，基因工程菌种能获得600 mg/g的总油脂含量，但是饱和脂肪酸的变化最为显著。该研究的顺利完成，基本阐明了CrFAX1和CrFAX2在莱茵衣藻细胞中脂肪酸跨膜运输和油脂合成中的作用，为进一步通过合成生物学的手段提高微藻细胞含油量具有重要的指导意义，同时该项目所获得的基因工程藻株可用于进一步的中试验证，为提高微藻产油效率提供基础数据。