ATF4调控内皮细胞一碳单位代谢分流影响血管生成的作用及机制研究

Angiogenesis in compromised tissue beds has been a long-standing goal in ischemic vascular diseases. Recently endothelial cell (EC) metabolism has been identified as a driver of angiogenesis for its functions of biomass synthesis and epigenetic maintenance. One-carbon (1C) flux is shunted into the metabolic pathways in nucleus and cytosol. There exists mutual competition between the two pathways. The nuclear-to-cytosolic shunt ratio influences cellular nucleic acid biosynthesis and methylation reaction. However, scarce researches have investigated the regulatory mechanism of 1C nuclear/cytosolic shunt and its role in angiogenesis. Activating transcription factor 4 (ATF4) mediates metabolic reprogramming in some pathological settings. We observed that the expression of ATF4 in EC under hypoxia was increased，overexpression or knockdown of ATF4 regulated the expression of some metabolic enzymes in 1C nuclear/cytosolic pathways，changed the relative level of cellular nucleic acid biosynthesis and methylation reaction，influenced angiogenesis. Based on these findings，we proposed the hypothesis that ATF4 influences angiogenesis via regulating the nuclear/cytosolic shunt of 1C metabolism. This project is designed to characterize the effects of ATF4 and 1C shunt on angiogenesis by employing endothelium-specific ATF4 transgenic mice and ischemia model in vivo, explore the molecular mechanism by which ATF4 regulates 1C shunt in primary mouse aortic endothelial cells and hypoxia model in vitro，thus provide new strategy for the therapeutic angiogenesis of ischemic vascular diseases.

血管生成是缺血性血管疾病的治疗靶点，内皮细胞代谢以参与生物合成及表观调控的方式影响血管生成。一碳单位（1C）胞核和胞质代谢途径相互竞争，其分流比例影响细胞核酸生物合成和甲基化水平，但目前对1C代谢胞核/胞质分流的调控及其在血管生成中的作用研究甚少。活化转录因子4（ATF4）介导某些病理条件下的代谢重构，我们前期发现缺氧时内皮细胞ATF4表达上调，干预ATF4表达则能影响1C代谢胞核/胞质途径相关酶的表达，改变内皮细胞核酸合成和甲基化水平，影响血管生成。据此，我们提出“ATF4通过调控内皮细胞1C代谢胞核/胞质分流影响血管生成”的假设。为此，本项目拟结合体内外缺血缺氧模型，在内皮特异性ATF4转基因小鼠中明确ATF4和1C代谢分流变化对血管生成的影响，并在小鼠原代主动脉内皮细胞中探索ATF4调控1C代谢胞核/胞质分流的分子机制，为缺血性血管疾病的治疗性血管生成提供全新策略。

治疗性血管新生是缺血性疾病的重要治疗手段，但相关临床试验却未提示显著临床获益，其具体原因仍需探讨。内皮细胞代谢是调控血管新生的重要机制。缺血性疾病患者常常合并肥胖等代谢合并症，导致局部组织代谢微环境改变。细胞代谢状态改变可影响细胞表观状态，而表观状态改变将影响细胞对外界刺激的反应。因此代谢微环境引起的内皮细胞代谢-表观状态改变或许是治疗性血管新生策略疗效欠佳的原因之一。ATF4参与细胞脂质代谢以及一碳代谢的调节。另外，ATF4可作为表观调控因子影响染色质结构，改变细胞表观状态。因此，ATF4极有可能是连接缺血组织局部代谢微环境改变与细胞表观状态的关键因素，进而影响内皮细胞的血管新生反应。. 本项目通过建立小鼠后肢缺血以及皮肤创伤愈合模型评价创伤后血管新生反应。构建鉴定饲养繁殖ATF4 +/-小鼠，观察ATF4缺乏对内皮细胞血管新生反应的影响。建立高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型，观察肥胖对创伤后血管新生反应的影响。体外予以棕榈酸和VEGF培养人心脏微血管内皮细胞和原代小鼠主动脉内皮细胞，并采用基因沉默和过表达技术干预ATF4表达，观察脂质过负荷状态下以及ATF4表达变化对VEGF诱导的血管新生反应的改变。利用染色质免疫沉淀-测序以及免疫沉淀技术了解在脂质过负荷状态以及ATF4表达水平、ATF4-MAT2A轴改变对NOS3和ERK1基因调节区域的H3K4水平的影响。. 本项目发现：肥胖状态损害创伤后血管新生反应，而ATF4缺乏将进一步加重肥胖导致的创伤后血管新生反应受损。ATF4过表达改善肥胖或脂质过负荷状态导致的创伤后或者VEGF诱导的血管新生反应受损。ATF4通过维持内皮细胞NOS3和ERK1基因调节区域的H3K4甲基化水平进而维持正常的内皮细胞血管新生反应。MAT2A是ATF4的靶基因，ATF4-MAT2A轴通过募集MLL1到NOS3和ERK1基因座位调节区域维持其H3K4甲基化水平。. 本研究说明缺血性疾病的肥胖合并症对创伤后血管新生反应具有重要影响。这主要是由于肥胖合并症对内皮细胞表观状态产生影响进而影响了内皮细胞对创伤后促血管生成因子等的反应。本研究提示内皮代谢-表观状态是治疗性血管新生反应的重要机制，根据缺血性疾病个体的代谢合并症予以适当的代谢或表观药物调进行个体化治疗，或许可改善目前治疗性血管新生疗法的疗效。