来源于Bispora sp. MEY-1的第十一家族嗜酸木聚糖酶XYL11B的酸适性机制研究

A xylanase with application potential in animal feed must be stable and highly active under extreme acidic conditions. A study of the molecular mechanism of acidophilic adaptation of acidophilic xylanases will elucidate the structure-function relationship in enzymes and develop better enzymes for use. Here we selected two xylanases of glycosyl hydralase family 11, XYL11B and XYL11P2, which shared high sequence identity of 90%, showed maximal activity at the same temperature and were complementary in functional pH ranges. XYL11B had pH optimum at 2.6 and lost activity at pHs above 5.5; XYL11P2 was optimally active at pH 5.5, remained 40% activity at pH 8.0 and had no activity at pH 3.0. Based on sequence alignment, homology modeling and structure comparison, a series of hybrid molecules will be constructed by rearrangement of protein module to identify the regions related to acidophilic adaptation. Then the conserved amino acids required for acidophilic adaptation will be further identified by alanine-scanning mutagenesis, and be mutated individually, or in combinations, to look for the key site. The results will lay a foundation for the acidophilic adaptation mechanisms in xylanases, and provide theoretical basis for pH modification of xylanases and other glycosyl hydrolases.

饲料用木聚糖酶需要在强酸性的条件下稳定并具有高活性。嗜酸木聚糖酶的嗜酸分子机理研究，有助于拓展对酶蛋白构效关系的了解, 获得性能更为优良的酶。我们获得了两个pH作用范围互补的十一家族木聚糖酶XYL11B和XYL11P2, 它们的氨基酸序列相似性极高(90%），最适温度相同，但pH特性差异很大,前者最适pH2.6，在pH高于5.5无活性；而后者最适pH5.5,在pH3时无活性，但在pH8时还有40%的酶活性。以此为核心材料，基于序列比对、同源建模和结构比对，通过模块重排构建杂合分子，分析确定与XYL11B酸适性相关的区段。通过适酸相关区段的丙氨酸扫描突变，确定维持XYL11B嗜酸性的必需保守氨基酸。对相关位点进行点突变并构建不同突变位点的随机组合突变文库，分析寻找与酶酸适性相关的关键位点。本研究为阐明木聚糖酶嗜酸机理提供依据，并为木聚糖酶及其它糖苷水解酶的pH适性改造提供理论指导。

饲料用木聚糖酶需要在强酸性的条件下稳定并具有高活性。嗜酸木聚糖酶的嗜酸分子机理研究，有助于拓展对酶蛋白构效关系的了解, 获得性能更为优良的饲料用酶。我们获得了两个pH作用范围互补的十一家族木聚糖酶XYL11B和XYL11P2, 它们的氨基酸序列相似性极高(90%），最适温度相同，但pH特性差异很大,前者最适pH2.6，在pH高于5.5无活性；而后者最适pH5.5, 在pH3时无活性，但在pH8时还有40%的酶活性。以此为核心材料，分别将XYL11B和XYL11P分成五小段，随机进行组合，按照排列组合共有32种组合进行了表达研究和性质测定。实验结果表明，XYL11B和XYNP13的第三段和第四段主要决定着其作用的pH值，并且第一段和第五段影响着木聚糖酶的比活力。将XYL11B第一段及第五段同时替换到XYNP13后，可使XYNP13的比活力大大提高10倍以上（1538U/mg vs 131 U/mg）。但当单独替换第一段或第五段时，XYNP13的比活力并没有明显的提高。通过适酸相关区段的突变研究，确定了维持XYL11B嗜酸性的必需保守氨基酸。对相关位点进行点突变，突变体N93E，N107W，S114A，V126L，137LPL139/137YRP139，E143Q，N174Q/K, I215T，S217G的最适pH值向碱性方向移动0.5-2.5个单位，但大部分突变体的酶活降低明显。实验证明Loop区对决定酶的催化特性（催化pH，催化效率）发挥着重要的作用。使用Non-contiguous schema进行分析，采用新的中碱性木聚糖酶芽孢杆菌来源的木聚糖酶（BreadGH11最适pH为6.0-7.0，在pH低于4.0时没有酶活，与XYL11B的在催化区的序列相似性为60%）进行反向突变研究。芽孢杆菌来源的木聚糖酶以BreadGH11为母本设计了6个突变体G43N44(BS1)，K52(BS2)，N78(BS3), 99-106(BS4)，I134(BS5), 175-178(BS6)，突变体, G43N44(BS1)，K52(BS2)，I134(BS5)最适pH为3-4.5，在pH2.0有较高的酶活，而在pH高于5.0时没有酶活。以嗜酸高比活的来源于蓝状菌木聚糖酶TlXyn11B为母本设计突变位点为7S1：14-19位替换BreadGH11的6-11位，7S3：S83C最