骨髓间充质干细胞复合猪脱细胞胆管支架材料治疗猪胆管缺损的实验研究

Tissue engineering bile duct matrix materials aimed at preserving the function of oddi’s sphincter have broad application prospects. However, there was no advance on developing the ideal scaffold materials. It is possible to resolve the poor blood supply and inflammation by obtaining extracellular matrix associated with proper seed cells. In this research, based on the elementary work on construction of artificial bile duct and prepare of whole liver acellular matrix, we try to obtain the bile duct acellular matrix, and seed GFP modified bone marrow derived mesenchymal stem cells on this scaffold. The interaction of scaffold and stem cells were investigated in vitro. Then, the new tissue engineering bile duct was used to treat bile duct defect. The therapeutic effect, differentiation of stem cells and inflammation regulation was investigated in vivo. The ultimate purpose of this project is to provide a new, safe, reliable, efficient treatment for bile duct defect, and lay the foundation for the development of Chinese independent intellectual property rights of new tissue engineering bile duct matrix material.

保留oddi氏括约肌功能的组织胆管支架材料治疗胆道疾病应用前景广阔，但目前仍未寻找到一种理想的支架材料。应用合适的方法获得天然胆管细胞外基质，联合合适的种子细胞，就能克服胆管修复的血供缺乏和胆汁刺激两大影响因素。本项目拟在申请人前期开展在人工胆管构建和全肝脱细胞支架制备的研究基础上，通过脱细胞技术获得保留维持胆管功能所需的纤维成分，空间结构和细胞因子，再将转染GFP的猪骨髓MSCs种植于支架表面，体外研究支架与细胞的相互作用；最后将种植猪骨髓MSCs的猪胆管脱细胞支架用于猪胆管部分缺损和节段性缺损的修复研究，观察其对胆管缺损的治疗作用和MSCs的分化和炎症调控作用。本研究结果将为组织工程胆管的构建提供一条新的思路，并为构建具有我国自主知识产权的新型的组织工程胆管奠定研究基础。

胆管支架材料为保留oddi氏括约肌功能的胆管修复方式带来了希望，尽管目前已有生物材料、合成材料修复效果往往不尽人意，脱细胞支架材料的出现，为这一研究领域带来了新的动力。应用合适的方法获得天然胆管细胞外基质，联合合适的种子细胞，就有希望克服胆管修复的血供缺乏和胆汁刺激两大影响因素实现缺损组织的修复重建。.本研究通过体外构建猪胆管脱细胞支架，体内动物实验探索猪胆管脱细胞支架材料联合猪骨髓间充质干细胞，治疗猪胆管缺损的修复效果。体外实验发现使用1%Triton X-100处理过的猪胆管脱细胞支架其支架结构成分的保留和生长因子的保留效果优于高浓度Triton X-100及SDS处理过的猪胆管脱细胞支架。并且处理后胆管组织细胞核残留及MHC抗原除去情况不劣于高浓度Triton X-100及SDS。.体内实验发现实验动物发生胆管阻塞率较高。实验动物因胆管阻塞造成实验失败，实验动物死亡率较高。实验中我们也观察发现部分实验动物能实现胆管缺损的修复，包括粘膜的爬行愈合，纤维组织再生，瘢痕区域缩小等，但添加MSCs与不添加MSCs相比在愈合效果上无显著性差异，也未能增加修复成功率，包括在加快粘膜愈合速度，纤维组织再生和瘢痕区域缩小上无显著优势。组织学检查未能检测到MSCs在体内分化和参与组织构建的现象，造成这种情况考虑可能与胆汁浸泡后支架材料环境恶劣，短期血管化速度慢，细胞处于缺血缺氧环境下饥饿、死亡。因此，MSCs可能仅在早期发挥一定的抗炎作用，未能继续分化参与修复重建。并且由于脱细胞支架材料早期缺乏有活力的平滑肌纤维及粘膜，本身容易出现塌陷，如果内支撑早期脱落，组织未能完成再生，容易导致实验失败，如何改善材料强度和弹性，提高干细胞在体内存活的时间，有待进一步的深入研究。.总之胆管脱细胞支架符合MSCs这种构建方式为保留oddi氏括约肌功能的胆管修复方式的研究做了一次新的领域的探索，具有一定的科学意义。