人毛囊隆突区神经嵴干细胞-黑素细胞定向分化的分子调控机制研究

毛囊隆突区为成年干细胞提供一栖居微环境，干细胞被激活与定向分化参与周期性毛囊结构更新重建和毛干着色。隆突区成年干细胞呈异质性，其微环境中可能存在有上皮干细胞，黑素细胞干细胞以及多能干的神经嵴干细胞（NCSC）。体外分离培养的NCSC可被诱导分化为黑素细胞，这些神经嵴干细胞衍生的黑素细胞（NCMC）推测参与白癜风皮损的毛囊复色。本课题用定向显微解剖技术分离人头皮毛囊隆突区细胞，建立并优化NCSC克隆（毛球）培养；观察能诱导白癜风毛囊复色的药物如甲氧沙林等和手段（UVA或窄谱UVB）对NCSC定向分化为NCMC的影响。在此基础上，我们用NCMC与人角质形成细胞混合培养重构三维表皮类似物，检测这些NCMC合成黑素与黑素小体转移的能力。本研究对认识人毛囊隆突区成年干细胞的分化调控机制，筛选新型高效诱导白癜风毛囊复色的药物（或手段）以及寻找用于白癜风黑素细胞移植治疗的替代细胞都有极大意义。

【背景】毛囊隆突区、毛囊间表皮的基底层以及真皮组织均存在有成体干细胞，参与皮肤稳态、皮肤的创伤后修复以及毛囊的周期性生长。【结果】① 用免疫荧光染色结合头皮组织连续切片技术发现毛囊隆突区外毛根鞘（ORS）被立毛肌（APM）附着处存在一特征性结节样结构，这些结节细胞呈现K15阳性，且结节样结构在胎儿头皮毛囊较成人头皮毛囊数目多且体积大，提示这些被立毛肌（APM）附着的隆突区外毛根鞘的结节样结构很可能是毛囊上皮干细胞壁龛；② 用显微解剖技术分离单根毛囊的中段（含隆突区）和毛球，荧光定量qRT-PCR array技术测定白发毛球和毛囊中段黑素（干）细胞的特异性基因（Tyr, Dct, 和Tyrp1）以及上皮干细胞特异性基因（K15和K19）表达水平下降；用电子自旋共振法（ESR）测定发现白发及黑发毛囊中部和毛球部羟自由基清除能力；蛋白印迹试验显示白发毛球和毛囊中段过氧化氢酶（catalase）蛋白水平，酶催化活性明显减低，提示早老性灰发可能关系到毛囊抗氧化能力下降以及隆突区黑素干细胞或上皮干细胞存在缺陷。此外，建立针尖皮肤切削术结合RT-PCR技术检测白癜风皮损组织中黑素（干）细胞谱系标记基因表达，成功预测白癜风皮损经308nm光疗后诱导毛囊复色的可能性。③ 用溴脱氧尿苷脉冲追踪标记（BrdU pulse-chase labeling）技术测定原代培养银屑病皮损角质形成细胞（KCs）的不对称分裂，结果发现BrdU标记DNA模板链不对称分离细胞对（cell pairs）的百分率明显高于正常皮肤培养的表皮细胞。还发现Th17细胞因子（IL-17A和IL-22）能维持体外培养KCs的未分化干细胞样表型，上调IKK信号分子的表达。④ 用RT-PCR技术发现MC1R在瘢痕疙瘩皮损成纤维细胞的表达水平比正常人成纤维细胞几乎减低一倍，且1 micro mol/L alpha-MSH不能抑制TGF-beta 1诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞的胶原合成，首次提出瘢痕疙瘩胶原过度合成，可能关系到成纤维细胞膜表面MC1R下调。【结论】认识这些成体干细胞在生理或病理状态下的存活、活化和分裂改变对揭示疾病的发病机制，判断临床治疗效果和寻找疾病新的治疗手段都具有重大意义。