基于“基因密码子扩展技术”的水泡性口炎病毒受体的发现

"基因密码子扩展技术"是利用终止密码子UAG编码非天然氨基酸表达体系，将具有特殊理化性质的非天然氨基酸表达到活细胞中蛋白质的特定位点，实现对活体中蛋白质作用网络的实时动态检测和功能操纵，是我国目前973计划研究项目。本项目利用该技术，将具有光交联活性的非天然氨基酸引入到水泡性口炎病毒的包膜蛋白VSVG中，在VSV感染细胞的动态过程中用365nm的紫外光激发非天然氨基酸，使VSVG及与其亲和的宿主细胞蛋白不可逆交联，从而捕获VSV感染所依赖的潜在受体和辅助受体。利用免疫沉淀等技术，分离纯化光交联蛋白复合物，质谱进行鉴定；进而通过抗体阻断和RNAi等技术手段验证交联蛋白是否参与了病毒进入细胞的过程。本课题将探寻与确定VSV包膜蛋白的潜在受体和辅助受体，为深入探讨VSV与宿主细胞间的相互作用和揭示VSV的分子致病机制提供新的依据；同时可为利用非天然氨基酸标记技术寻找其他病毒进入细胞受体提供借鉴。

病毒对细胞的感染过程，实质上就是病毒的蛋白和位于宿主细胞表层的特有受体相互作用的过程，即病毒蛋白和受体蛋白的识别、结合最后达到融合。研究蛋白—蛋白间的相互作用，特别是研究病毒膜蛋白（或衣壳蛋白）与细胞受体的相互作用，包括它们结合和融合的动态过程及结构基础，对于阐明传染病发生发展的过程，揭示病毒入侵的分子机制及规律，确定潜在的治疗靶点，设计病毒的疫苗和研制小分子药物都是至关重要的。但受限于传统研究蛋白相互作用方法的局限性，一些与病毒作用时间短暂，结合力弱的受体很难被鉴定出来。针对这一问题，我们将“基因密码子扩展技术”应用于病毒受体研究这一领域。“基因密码子扩展技术”是利用非天然氨基酸表达体系，将具有特殊物理、化学性质的非天然氨基酸表达到活细胞中蛋白质的特定位点，实现对蛋白质的高时空精度操纵。该技术适用于病毒感染细胞受体的发现，特别是那些结合弱或呈瞬间方式作用的互作蛋白。.VSV是弹状病毒科的代表毒株，具有广泛的组织细胞嗜性，能在多种实验室培养的细胞内生长，并引起明显的细胞病变效应（CPE），在研究病毒的吸附、侵入、复制和装配等方面是一个很好的模型。VSV为单股负链RNA病毒，其结构简单、复制能力较强、疾病过程短，所以被广泛用于研究RNA病毒的进化。VSV的基因组背景清楚，大小适当，便于操作，VSV病毒载体是近年来发展较快的一种RNA 病毒载体。.本研究以探寻和确定VSV可能存在的新受体为切入点，不仅为研究G蛋白及其受体提供新的依据，同时有助于揭示病毒的感染途径和复制过程等一系列科学问题，而且也为以基于“基因密码子扩展技术”发现其它致病病毒的受体奠定基础。.我们构建了慢病毒载体即基于对慢病毒（例如HIV）的改造而得到的包膜蛋白为VSVg而内含遗传物质为修饰后的HIV基因组骨架载体。我们将含有光交联基团的非天然氨基酸插入到VSV慢病毒载体的多个位点，通过光交联，找到多个参与病毒生命过程的细胞因子。我们将具有叠氮基团的把手氨基酸高效、位点特异性地标记在VSV慢病毒表面上，结合生物兼容的Click反应，将荧光分子共价连接到病毒表面，观察了病毒感染宿主细胞的动态过程，追踪了病毒在宿主细胞中的运动轨迹。建立了简便易行、荧光时间长且pH稳定的单病毒标记方法。.