蛋白质脂基化修饰的时空特异性检测

Protein lipidation is an important class of post-translational protein modifications and regulates many fundamental aspects of protein function, such as the proper subcellular localization. Inside the cell, protein lipidation can be spatially and temporally regulated, exhibiting distinct patterns in various subcellular compartments. In the case of S-palmitoylation, protein lipidation can be reversely regulated by the concerted actions of protein palmitoyl transferase (as a writer) and palmitoylated protein thioesterase (as an eraser), which regulates protein shuttling between the membrane and the cytoplasm. Existing technologies for investigating protein lipidation do not provide information on the spatial heterogeneity of modification. In this proposal, we aim to develop a novel spatial-specific proteomic profiling technique, for studying protein lipidation in various subcellular compartments, at proteomic levels. This new method promises to reveal the spatial-temporal pattern of protein lipidation. As a proof of concept, we propose to investigate the spectrum of protein lipidation that occurs locally at the neuronal synapse.

脂基化是一类重要的蛋白质翻译后修饰过程，对于调节蛋白质的亚细胞定位及功能有着重要意义。蛋白质脂基化具有时空特异性的特征，即可以受外界信号调控，在细胞局部区域中独立进行。以S-棕榈酰化为代笔的蛋白质脂基化还具有动态可逆的特点，能够在修饰酶（棕榈酰转移酶）和去修饰酶（棕榈酰蛋白硫酯酶）的协调作用下，快速实现蛋白质在不同细胞区域间的定向转运。然而，受传统研究手段的限制，蛋白质脂基化的检测往往只能在全细胞水平进行，不能得到亚细胞区域特异性的脂基化底物信息。本项目立足于发展新型的空间特异性蛋白质标记方法，结合代谢标记与生物正交反应等手段，实现在全蛋白质组水平上针对脂基化修饰的时空特异性检测。通过研究神经突触中蛋白质脂基化的底物，解析长时程增强过程中蛋白质脂基化的时空动态变化，以期在全蛋白质组水平上加深我们对长时程记忆分子机制的理解。

本研究项目以发展具有高时空分辨能力的蛋白质翻译后修饰分析技术为主要目标，通过酶介导的邻近化学标记反应和正交富集策略，实现了在活细胞中针对特定亚细胞区域的生物大分子进行空间特异性标记及高通量分析手段。项目执行期间，共合成和表征了十余种新型的APEX酶底物探针，从中筛选获得了邻近标记活性提高一个数量级的新探针，从而大幅提高了正交富集的灵敏度。该方法突破了传统研究蛋白质翻译后修饰难以获得高空间分辨的限制，使蛋白质翻译后修饰的检测从全细胞水平推进至包括线粒体、内质网、细胞膜、神经突触等多个亚细胞区域中。该研究项目还发展了基于光敏反应的生物大分子标记技术，利用在细胞中可控生成单线态氧等活性氧物种对特定靶点中的蛋白质、核酸等分子进行氧化损伤和共价标记，实现了在分钟级别分辨率下的亚细胞蛋白质组和转录组分析。以上工作将更好地帮助我们在组学水平上理解蛋白质翻译后修饰在细胞局部信号转导中的功能。在项目执行期间，在基金的资助下共发表研究论文6篇，包括《Nat. Chem. Biol.》一篇、《Angew. Chem. Int. Ed.》两篇，另应邀撰写综述1篇。培养博士研究生1名。