猪细小病毒非结构蛋白拮抗干扰素功能研究

猪细小病毒（porcine parvovirus, PPV）是引起母猪繁殖障碍的重要病原。基于PPV在我国的猪群中广泛存在与对初产母猪的危害，本研究在现有的研究基础上，利用流式细胞仪技术，定量RT-PCR，Westerntblot等技术，研究PPV病毒与其非结构蛋白在细胞模型中引起的细胞I型干扰素水平以及Ⅰ型干扰素信号通路中重要因子的表达水平变化情况。从而研究PPV非结构蛋白在拮抗干扰素中的作用，揭示PPV致病机理与逃避宿主免疫的分子机制。

猪细小病毒（PPV）主要引起初产母猪繁殖障碍，引起胎猪死产、木乃伊胎、早期胚胎死亡等。目前，PPV的致病机理尚不清楚。PPV基因组有两个开放阅读框（ORF），ORF1编码非结构蛋白，ORF2 编码结构蛋白。非结构蛋白包含三个非结构蛋白：NS1、 NS2和NS3，这些非结构蛋白在病毒复制中发挥重要的作用。但是，PPV非结构蛋白在与宿主天然免疫功能之间关系的研究较少。本研究利用体外方法系统研究了PPV与宿主的IFN通路之间的关系。首先，我们建立了PPV在体外稳定繁殖的ST细胞模型。PPV-BQ株在ST细胞中繁殖良好，感染后60-72小时，病毒滴度达到高峰。为了检测细胞中IFN通路中细胞因子的变化情况，我们建立了用于特异检测猪的IFN通路中的细胞因子（IFN-α、IFN-β、TLR-9、RIG-1、IRF-3、IRF-7 、JAK-1 、JAK-2、STAT-1、STAT-2）的荧光定量PCR方法。本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好，适于对猪IFN相关传导因子的定量检测。利用该方法对PPV感染ST细胞后IFN通路细胞因子的转录水平进行了检测，结果表明：IFN-α和IFN-β的转录水平上调，RIG-1、JAK-2和STAT-2 mRNA水平没有明显变化，而TLR-9的转录水平在感染后出现了明显升高，IRF-3和IRF-7都有不同程度的上调；从60h开始，JAK-1转录水平呈现升高的趋势；STAT-1的转录水平存在明显的提高。因此，ST细胞在PPV入侵后，主要通过跨膜途径诱导干扰素产生而发挥抗病毒效应，即位于细胞膜上TLR-9识别PPV的核酸，进而通过激活相应的信号通路诱导干扰素的产生；而RNA聚合酶Ⅲ-RIG-1信号传导通路在PPV感染过程中可能不发挥主要作用，IRF-3和IRF-7参与了病毒诱导干扰素产生的信号传导；JAK-STAT信号传导通路中发挥效应的可能是JAK-1和STAT-1。利用荧光素酶双报告基因法研究发现，PPV的感染对IFN-β启动子没有明显的激活作用；而当感染了PPV的ST细胞转染Poly (I:C)诱导剂后，IFN-β启动子受到明显的抑制，表明PPV可以阻断Poly (I:C)介导的IFN-β的表达。对PPV编码蛋白与IFN-β启动子相互作用的研究发现，非结构蛋白基因（NS2）具有抑制IFN-β的启动子激活的作用。