A型流感病毒在出芽过程中对核糖核蛋白体（Ribonucleoprotein，RNP）包装机制研究

Influenza is an enveloped virus that release from the infected cell by budding. Incorporation of complete RNP set is critical for infectious progeny virus during budding process. Up to now, the mechanism of RNP incorporation remains unclear. The attempt of this study is exploring how the cell protein and viral protein help RNP incorporation during virus budding. Our preliminary data indicated that M2 protein interact with NP directly, and help NP bud from cell. Since NP is the main component of viral RNP, we hypothesize that M2 protein is able to help RNP incorporation during virus budding by interacting with NP protein. On the cell level, recently, light chain 3 (LC3) was recruited to the influenza virus budding sites by interacting with M2, which can inhibit the autophagy of infected cells. However, the function of LC3 in the virus budding sites remain unknown, we propose that the LC3 protein may help virus budding and modulate the RNP incorporation. In this study, we will explore the mechanism of RNP incorporation during virus budding, which will be helpful for novel anti-influenza drug design.

流感病毒属于囊膜病毒，以出芽的方式从感染细胞中释放病毒。在病毒出芽过程中，携带完整的核糖核蛋白体（Ribonucleoprotein，RNP）是保持后代病毒具有感染性的关键。但是到目前为止，流感病毒RNP包装的机制尚不清楚。本研究从病毒水平与细胞水平两个方面试图揭示流感病毒RNP包装的机制。在病毒水平，本研究初期结果首次证明流感病毒的M2蛋白与NP蛋白直接相互作用，并且协助NP出芽释放到细胞上清中。鉴于NP是RNP中含量最高的蛋白，M2是否通过与NP互作从而协助病毒RNP包装及机制需要进一步研究。在细胞水平，最近研究发现Light chain 3（LC3）蛋白可被M2招募到流感病毒出芽部位，但是其在流感病毒RNP包装中的作用还不清楚。基于以上发现，对流感病毒RNP包装过程进行研究，试图揭示RNP包装机制，这有助于深层次了解流感病毒复制周期中关键步骤，为新型抗病毒药物设计提供新靶点。

流感病毒属于囊膜病毒，以出芽的方式从感染细胞中释放病毒。在病毒出芽过程中，携带完整的核糖核蛋白体（Ribonucleoprotein，RNP）是保持后代病毒具有感染性的关键。但是到目前为止，流感病毒RNP包装的机制尚不清楚。本研究从病毒水平与细胞水平两个方面试图揭示流感病毒RNP包装的机制。在病毒水平，本研究发现流感病毒在复制的后期，M2蛋白与NP蛋白共定位在细胞膜上，暗示M2蛋白在病毒核糖核蛋白体包装出芽过程中发挥作用。本研究结果首次发现M2可以与核糖核蛋白体的NP蛋白存在直接互作，并可以协助NP蛋白完成出芽，进一步协助病毒对基因组的包装。M2蛋白是一种跨膜蛋白，通过截断突变研究发现，M2的胞内区域与NP蛋白存在互作，而且，M2跨膜区域也是影响M2蛋白出芽的关键区域。在细胞水平，最近研究发现Light chain 3（LC3）蛋白可以与M2直接互作并被招募到流感病毒出芽部位，但是此行为的目的与意义尚不清楚。为了验证LC3蛋白在病毒包装中的作用，本研究中，我们构建了携带M2蛋白突变的WSN-FVI/SSS流感病毒，M2蛋白突变后不能与LC3-II互作。结果显示，突变病毒对胰酶的耐受力下降。此胰酶消化实验与电镜观察结果证明，M2突变的病毒外膜存在缺失，外膜不完整。为了进一步验证LC3蛋白在病毒出芽与外膜完整性中作用，我们构建了LC3敲除的A549的细胞系（A549-LC3-KO）, 在A549-LC3-KO上繁殖的病毒通过胰酶消化实验与电镜观察结果显示并没有存在明显的外膜缺失与对胰酶抗性的变化。此结果说明M2蛋白突变的WSN-FVI/SSS流感病毒的外膜不完整是由于M2的突变改变了M2蛋白的功能造成的，而非LC3蛋白。进一步研究发现M2 -FVI/SSS蛋白突变后，突变蛋白的出芽能力显著受到影响，说明M2的胞内区的疏水性氨基酸是影响病毒出芽与外膜完整性的重要区域。总之，本研究发现M2蛋白是流感病毒对vRNPs包装与保持病毒外膜完整性的关键蛋白，而且M2蛋白胞内区域是关键功能区域。